1、DNA提取過程中各種試劑的作用及原理1溶液I溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。 2溶液IINaOHSDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩定的。但當pH12或pH3時，就會引起

2、雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6， 因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。 SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-R-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。 3. 溶液III-3molL NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調

3、節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，并能穩定存在。而高鹽的3molL NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更完全。 4為什么用無水乙醇沉淀DNA？ 用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全

4、，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用95乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95乙醇昂貴）。但是加95的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530分鐘即可。 5在用乙醇沉淀DNA時，為

5、什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.10.25mol/L？ 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。 6加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？ 加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去

6、除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀，再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。 7為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？ 在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa7.2）和硼酸系統（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2產生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反應時，

7、不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定 。氯仿的作用主要是使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇的作用是消除抽提過程中出現的泡沫。氯仿是強蛋白質變性劑，抑制RNA酶的活性，除去蛋白質污染。基因組DNA- CTAB法CTAB法原理(植物DNA提取經典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨

8、),是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性.在高離子強度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物,只是不能沉淀核酸.通過有機溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來.注:CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出,因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預熱,且離心時溫度不要低于15.基因組DNA- CTAB法CTAB提取緩沖液的經典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一個緩沖環境,防止核酸被破壞;EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性;NaCl 提供一個高鹽環境,使DNP充分溶解,存在于

9、液相中;CTAB溶解細胞膜,并結合核酸,使核酸便于分離;-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA- CTAB法CTAB提取緩沖液的改進配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合物,能與多酚形成一種不溶的絡合物質,有效去除多酚,減少DNA中酚的污染;同時它也能和多糖結合,有效去除多糖.基因組DNA的提取核酸分離,純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時,應提供相應的緩沖體系采用有機(酚/氯仿)抽提時應充分混勻,但動作要輕柔離心分離兩相時,應保證一定的轉速和時間針對不同材料的特點,在提取過程中輔以相應的去雜質的方法基因組DNA的提取核酸分離,純化蛋白質的去除:酚/氯

10、仿抽提使用變性劑變性(SDS,異硫氰酸胍等)高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離,純化多糖的去除:高鹽法:用乙醇沉淀時,在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl,高鹽可溶解多糖.用多糖水解酶將多糖降解.在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積),氯苯可以與多糖的羥基作用,從而去除多糖 .用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500 L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ,冰浴20min.核酸分離,純化多酚的去除:在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑:-巰基乙醇,抗壞血酸,半胱氨酸,二硫蘇糖醇等加入易與酚類結合的試劑:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),

11、它們與酚類有較強的親和力,可防止酚類與DNA的結合鹽離子的去除:70%的乙醇洗滌核酸吸附,沉淀和溶解使用合適的吸附材料吸附核酸,其它的雜質均被洗掉,達到純化DNA的目的另一種方式加入1/10體積的NaAc(pH5.2,3M),用預冷的乙醇或異丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后應用70%的乙醇洗滌,以除去鹽離子等若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNasepH值為8.0,可防止DNA發生酸解 。基因組DNA提取常見問題DNA中含有蛋白,多糖,多酚類雜質DNA在溶解前,有酒精殘留,酒精抑制后續酶解反應DNA中殘留有金屬離子有RNA的存留原因對策重新純化DNA,過吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等雜質重新沉淀DNA,讓酒精充分揮發增加70%乙醇洗滌的次數(2-3次)加入RNase降解RNA問題一:DNA樣品不純,抑制后續酶解和PCR反應.DNA提取常見問題材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈,DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融。盡量取新鮮材料,低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后,應在解凍前加入裂解緩沖液在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時,可增加裂解液中螯合劑的含量,細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔所有試劑用無菌水配制,耗材經高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中,避免反復凍融問題二:DNA降解.DNA提取常