1、1 kromtrfi2關鍵詞：氣相色譜； 塔板理論； 速率理論； 分離度； 保留值； 定量校正因子； 定量方法3 第一節第一節 概述概述 色譜法是一種混合物高效分離、色譜法是一種混合物高效分離、分析技術。是復雜混合物成分分析分析技術。是復雜混合物成分分析和結構測定的重要工具。和結構測定的重要工具。一一. .色譜法由來及發展色譜法由來及發展 由俄國植物學家 ( (茨維特,Tswett）1906(3)年創立。 4Michael Tswett(1872-1919), a Russian botanist , discovered the basic principles of column chro

2、matography. He separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate. The various pigments separated into colored bands; hence the name chromatography. 5 為了分離植物色素，將植物為了分離植物色素，將植物綠葉的石油醚提取液倒入裝有碳綠葉的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣粉末的玻璃管中，并用石油酸鈣粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色醚自上而下淋洗，由于不

3、同的色素在碳酸鈣顆粒表面的吸附力不素在碳酸鈣顆粒表面的吸附力不同，隨著淋洗的進行，不同色素同，隨著淋洗的進行，不同色素向下移動的速度不同，形成一圈向下移動的速度不同，形成一圈圈不同顏色的色帶，使各色素成圈不同顏色的色帶，使各色素成分得到了分離。他將這種分離方分得到了分離。他將這種分離方法命名為色譜法。法命名為色譜法。67 之后，1948年瑞典生物化學家蒂西利烏斯（Tiselius)由于在電泳分析和吸附色譜等方面的重要貢獻，獲得諾貝爾化學獎。 8 1941年英國生物化學家 Martin和Synge在研究乙酰氨基酸的分離時，發展了液液分配色譜法，開創了分配色譜的新階段，指出： 試樣混合物的分離過程

4、是試樣中各組分在色譜分離柱中的兩相間不斷進行著的分配過程。其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體（氣體或液體），稱為流動相。9n在色譜發展史上占有重要地位的英國人A.J. P. A.J. P. Martin(Martin(馬丁馬丁) )和和R.L.M. Synge(R.L.M. Synge(辛格辛格) )，提出:n色譜塔板理論；n發明液-液分配色譜；n預言了氣體可作為流動相（即氣相色譜）。 1952年，因為他們對分配色譜理論的貢獻獲諾貝爾化學獎。 Nobel Prize in Chemistry (1952) for the invention of part

5、ition chromatography10n此后，色譜法不僅用于分離有色物質，不僅用于分離有色物質，還用于分離無色物質，并出現了種類繁還用于分離無色物質，并出現了種類繁多的各種色譜法。多的各種色譜法。n分離無顏色的物質也沿用色譜的概念11年代年代發明者發明者發明的色譜方法或重要應用發明的色譜方法或重要應用1906Tswett用碳酸鈣作吸附劑分離植物色素。最先提出色譜概念。1931Kuhn, Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離a-、b-和g-胡蘿卜素。使色譜法開始為人們所重視。1938Izmailov, Shraiber最先使用薄層色譜法。1938Taylor, Uray用離子交換色譜法分離了

6、鋰和鉀的同位素。1941Martin, Synge提出色譜塔板理論；發明液-液分配色譜；預言了氣體可作為流動相（即氣相色譜）。1944Consden等發明了紙色譜。1949Macllean在氧化鋁中加入淀粉黏合劑制作薄層板使薄層色譜進入實用階段。1952Martin, James從理論和實踐方面完善了氣-液分配色譜法。1956Van Deemter等提出色譜速率理論，并應用于氣相色譜。1957基于離子交換色譜的氨基酸分析專用儀器問世。1958Golay發明毛細管柱氣相色譜。1959Porath, Flodin發表凝膠過濾色譜的報告。1964Moore發明凝膠滲透色譜。1965Giddings發

7、展了色譜理論，為色譜學的發展奠定了理論基礎。1975Small發明了以離子交換劑為固定相、強電解質為流動相，采用抑制型電導檢測的新型離子色譜法。1981Jorgenson等創立了毛細管電泳法。12色譜法起過關鍵作用的諾貝爾獎研究工作年代年代獲獎學科獲獎學科獲獎研究工作獲獎研究工作1937化學類胡蘿卜素化學，維生素A和B1938化學類胡蘿卜素化學1939化學聚甲烯和高萜烯化學1950生理學、醫學性激素化學及其分離、腎皮素化學及其分離1951化學超鈾元素的發現1955化學腦下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化學胰島素的結構1961化學光合作用時發生的化學反應的確認1970生理學、醫學關于神

8、經元觸處遷移物質的研究1970化學糖核苷酸的發現及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化學核糖核酸化學酶結構的研究1972生理學、醫學抗體結構的研究13二二. . 色譜法分類色譜法分類 n按流動相分類按流動相分類 氣相色譜氣相色譜GCGC（氣固（氣固GSCGSC、氣液、氣液GLCGLC） 液相色譜液相色譜LCLC（液固（液固LSCLSC、液液、液液LLCLLC）n按固定相形狀分類按固定相形狀分類 柱色譜柱色譜CCCC（填充柱、毛細管柱）（填充柱、毛細管柱） 薄層色譜薄層色譜TLCTLC（板色譜）（板色譜） 紙色譜紙色譜1415按分離原理分類按分離原理分類 吸附色譜（氣固）吸附色譜（氣固） 分

9、配色譜（氣液、液液）分配色譜（氣液、液液） 離子交換色譜離子交換色譜 測定帶電荷混合物測定帶電荷混合物 凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜 測聚合物分子量分布。 毛細管電泳毛細管電泳 九十年代快速發展、九十年代快速發展、特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。特別適合生物試樣分析分離的高效分析儀器。161718三、氣相色譜儀的組成 以氣體作流動相的柱色譜法，稱為氣相色譜法（GC)。由五大部分組成：1 1 載氣系統載氣系統2 2 進樣系統進樣系統3 3 分離系統分離系統 ( (色譜柱)4 4 溫控系統溫控系統 5 5 檢測系統檢測系統19202122231. 1. 載氣系統載氣系統1 1）載氣）載氣， 主

10、要有氫氣、氮氣、氦氣和氬氣。用高壓鋼瓶貯存。2 2） 穩壓恒流裝置穩壓恒流裝置，穩壓閥可減壓，使載氣流速穩定。3 3）凈化器）凈化器， 提高載氣純度，凈化劑主要有活性炭、分子篩、銅催化劑等分別除去載氣中的烴類、水、氧氣。242. 2. 進樣系統進樣系統 包括進樣器和氣化室。進樣器進樣器: :液體樣品進樣器進樣器：微量注射器，1-50uL;氣體樣品進樣器：氣體管，1-5mL;六通閥.氣化室氣化室：要求樣品在氣化室中瞬間氣化而不分解。要求氣化室熱容量要大，死體積應盡可能小。25263 3 分離系統分離系統 -色譜柱色譜柱 樣品中各組分在色譜柱中得到分離。樣品中各組分在色譜柱中得到分離。1 1）填充

11、柱）填充柱（Packed columnPacked column） （1 1） 柱管：柱管：L 2-10m 2-6mmL 2-10m 2-6mm （2 2） 固定相固定相 固體固定相：硅膠，氧化鋁等固體固定相：硅膠，氧化鋁等 液體固定相：擔體上涂覆固定液液體固定相：擔體上涂覆固定液27282 2） 毛細管柱（毛細管柱（capillary columncapillary column） 柱管：柱管：L 30m-50mL 30m-50m0.25mm0.25mm， 0.35mm 0.35mm ，0.53mm0.53mm等等 空心毛細管內壁涂覆、鍵合、空心毛細管內壁涂覆、鍵合、 交聯固定液交聯固定液2

12、9304. 4. 溫控系統溫控系統 溫度是氣相色譜的重要參數。 溫控系統是用來設定、控制、測量色譜柱箱、氣化室、檢測器三處的溫度。 多采用可控硅溫度控制器可控硅溫度控制器進行連續精密控制。0.1以內。315. 5. 檢測與記錄系統檢測與記錄系統 將樣品量信號轉化為電信號，并顯示、處理和打印的系統。 檢測器后面還要詳細講解。32 四、氣相色譜法的特點和應用范圍四、氣相色譜法的特點和應用范圍 特點： 1）分離效能高；組成復雜；性質相近 例如：石油氣（C1-C4）的成分分析，目前都采用氣相色譜法。以25%丁酮酸乙酯為固定液，6201擔體，柱長12.15m，內徑4mm,柱溫 12,氫為載氣，流速25m

13、l/nin，熱導池電橋電流120-150mA, C1-C4各組分得到較好的分離。331-空氣；2-乙烷；3-乙烯；4-二氧化碳；5-丙烷；6-丙烯；7-異丁烷; 8-乙炔；9-正丁烷；10-正丁烯；11-異丁烯12- 反丁烯; 13- 順丁烯;14-1，4-丁二烯 。342）靈敏度高；最小檢出量10-11- -13g3）分析速度快；幾-幾十分鐘4）應用范圍廣：普及35 一、色譜分離過程一、色譜分離過程 色譜分離過程是在色譜柱內完成的。色譜分離過程是在色譜柱內完成的。 填充柱色譜包括氣固色譜和氣液色譜，兩填充柱色譜包括氣固色譜和氣液色譜，兩者的分離機理不同。者的分離機理不同。 氣固色譜的固定相氣

14、固色譜的固定相: : “多孔性的固體吸附多孔性的固體吸附劑顆粒劑顆粒”, , 分離基于分離基于固體吸附劑對試樣中各組固體吸附劑對試樣中各組分的吸附能力的不同。分的吸附能力的不同。 36氣液色譜的固定相氣液色譜的固定相: : 由擔體和固定液所組成由擔體和固定液所組成, , 分離分離基于基于固定液對試樣中各組分的溶解固定液對試樣中各組分的溶解能力的不同能力的不同. .氣固色譜的分離氣固色譜的分離: :吸附與脫附的平衡吸附與脫附的平衡過程，不斷重復；過程，不斷重復；氣液色譜的分離：氣液色譜的分離：氣液兩相間的反復氣液兩相間的反復多次溶解、揮發的分配過程。多次溶解、揮發的分配過程。37氣相色譜分離過程

15、氣相色譜分離過程 當試樣由載氣攜帶當試樣由載氣攜帶進入色譜柱與固定相接進入色譜柱與固定相接觸時，被固定相溶解或觸時，被固定相溶解或吸附吸附; ; 隨著載氣的不斷通入隨著載氣的不斷通入，被溶解或吸附的組分，被溶解或吸附的組分又從固定相中揮發或脫又從固定相中揮發或脫附附; ; 揮發或脫附下的組分揮發或脫附下的組分隨著載氣向前移動時又隨著載氣向前移動時又再次被固定相溶解或吸再次被固定相溶解或吸附附; ; 隨著載氣的流動，溶隨著載氣的流動，溶解、揮發，或吸附、脫解、揮發，或吸附、脫附的過程反復地進行。附的過程反復地進行。381. 1. 分配系數分配系數（ partition factor），）， K

16、組分在固定相和流動相之間發生的吸附、組分在固定相和流動相之間發生的吸附、脫附，或溶解、揮發的過程叫做分配過程。脫附，或溶解、揮發的過程叫做分配過程。 在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的濃度（單位：衡時的濃度（單位：g / mL）比，稱為分配系數，）比，稱為分配系數，用用K 表示，即：表示，即：M ccKS組分在流動相中的濃度組分在固定相中的濃度混合物中各組分分配系數的差異是色譜分離的依據混合物中各組分分配系數的差異是色譜分離的依據influence factor ？39分配系數分配系數 K 的討論的討論i. 一定溫度下，組分的分配系數一定溫度下，組分

17、的分配系數 K K 越大，出越大，出峰越慢；若組分的峰越慢；若組分的K = 0K = 0時，即不會被固定時，即不會被固定相保留，最先流出柱。相保留，最先流出柱。ii.ii.試樣一定時，試樣一定時，K K主要取決于固定相性質。主要取決于固定相性質。iii.iii.試樣中的各組分具有不同的試樣中的各組分具有不同的K K值是分離的基值是分離的基礎礎 組組分分在在流流動動相相中中的的濃濃度度組組分分在在固固定定相相中中的的濃濃度度 K402.2.分配比分配比 （partition ratio）k 在實際工作中，也常用分配比來表征色譜分在實際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平衡過程。分配比是指，在一定

18、溫度下，組分配平衡過程。分配比是指，在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質量比在兩相間分配達到平衡時的質量比：MSMMSSSVVKVcVcmmkM 組分在流動相中的質量組分在固定相中的質量 分配比也稱：分配比也稱： 容量因子容量因子(capacity factor)；或容；或容量比。量比。41小結小結1 1）分配系數與分配比都是與組分及固定相的）分配系數與分配比都是與組分及固定相的熱熱力學性質有關力學性質有關的常數，隨分離的常數，隨分離柱溫度、柱壓柱溫度、柱壓的的改變而變化。改變而變化。 2 2）分配系數與分配比都是衡量色譜柱對組分保）分配系數與分配比都是衡量色譜柱對組分保留能力的參數，

19、數值越大，該組分的保留時間留能力的參數，數值越大，該組分的保留時間越長。越長。 3 3）分配比可以由實驗測得。）分配比可以由實驗測得。42 試樣中的各組分經色譜柱分離后，隨載試樣中的各組分經色譜柱分離后，隨載氣依次進入檢測器，經檢測器將組分質量或氣依次進入檢測器，經檢測器將組分質量或濃度變化轉變為電信號，并濃度變化轉變為電信號，并以信號變化對流以信號變化對流出時間作圖，則得到一條呈正態分布的色譜出時間作圖，則得到一條呈正態分布的色譜流出曲線，稱為色譜圖流出曲線，稱為色譜圖。4344色譜峰色譜峰：流出曲線上的突起部分， 多呈正態分布。 當僅有流動相通過時，檢測器響應信號隨時間變化的曲線（穩定時為

20、水平直線） 基線漂移45保留時間保留時間tR(retention time )：從進樣開始到待測組分出現濃度極大點時所需時間，即組分通過色譜柱所需要的時間死時間死時間tM (或 t0,dead time)：不被固定相溶解或吸附的組分的保留時間，（即空氣的保留時間）。調整保留時間調整保留時間：待測組分的保留時間與死時間之差值， 即組分在固定相中滯留的時間 = tR tMRt47保留體積保留體積VR：從進樣開始到組分出現濃度極大點時所消耗的流動相的體積 F0 -載氣流速載氣流速 0FtVRR001FtFVRR無關；為定值，與注：48死體積死體積VM： 不被保留的組分通過色譜柱所消耗的流 動相的體積

21、，又指色譜柱中未被固定相所占據的空隙體積，即色譜柱的流動相體積（包括固定相空隙、色譜儀中的管路、連接頭的空間、以及進樣器和檢測器的空間）0FtVMM001FtFVMM無關；為定值，與注：49調整保留體積調整保留體積VR：保留體積與死體積之差，即組分停留在固定相時所消耗流動相的體積相對保留值相對保留值ri ,j（選擇性系數 ）：i組分與j組分調整保留值之比0FtVVVRMRRjijiRRRRjiVVttr，50分配比k-組分調整保留時間與死 時間的比值。121212RRRRVVttr，MRttk51分配比分配比 k 的求算：的求算：1）組分分配在流動相中的分數）組分分配在流動相中的分數RS：2）

22、因此，）因此，k11mmmuuRsmmss 流動相線速度流動相線速度組分線速度組分線速度0rstLu，tLu 0r0r00r0rVVtttttk)k1(tt 或或5253峰底寬度峰底寬度Y Y（或（或W）：正態分布色譜流出曲線兩拐點處切線與基線相交的截距標準偏差標準偏差：正態分布色譜曲線0.607倍峰高處峰寬的一半半峰寬半峰寬Y Y 1/21/2 ( (或或W1/2)：峰高一半處所對應的峰寬355. 221Y4Y21699. 1YY 54 （一）基本假設： 塔板模型是將一根色譜柱視為一個精餾塔，柱內有若干塊想象的塔板。色譜柱每個H高度內有一塊塔板，H稱為塔板高度，簡稱板高(theoretica

23、l plate height) 。 塔板理論假設：在每一塊塔板上，組分在兩相間分配很快達到平衡，然后隨著流動相按一個一個塔板的方式向前轉移，每經過一個板高（一塊塔板）平衡分配一次。55 根據塔板理論，溶質進入柱入口后，即在兩相間進行分配。 對于正常的色譜柱，溶質在兩相間達到分配平衡的次數在數千次以上，最后，揮發度最大（保留最弱）的溶質最先從塔頂（色譜柱出口）逸出（流出），從而使不同揮發度（保留值）的溶質實現相互分離。 57分配平衡的次數： n = L/H n-分配平衡的次數，即理論塔板數（the number of theoretical plates） ； L-色譜柱的長度； H-塔板高度（

24、虛擬的塔板間距離）虛擬的塔板間距離） 。 色譜柱柱效隨理論塔板數n增加而增加，隨板高H的增大而減小。58（二）塔板理論的內涵1）理論塔板數n大于50時，可得到基本對稱的峰形曲線。n很大（103-106）時，流出曲線為峰寬較窄的正態分布曲線。2）當樣品進入色譜柱后，只要各組分在兩相間的分配系數有微小差異，經過反復多次的分配平衡以后，就可獲得良好的分離。K小的先出峰。如果兩組分的K相同，則分不開。5922212)(16)(54. 5)(YtYttnRRR理3）理論塔板數n理與區域寬度的關系式為：理理HLn理理或nLH/注意：對同一根柱子，用不同物質計算可注意：對同一根柱子，用不同物質計算可得到不同

25、的理論塔板數得到不同的理論塔板數60 由此可以看出，在tR一定時，色譜峰越窄、塔板數n越多，板高H越小，組分被分配的次數越多，則柱效越高。 n填充色譜柱的填充色譜柱的 n n10103 3， H H1mm1mm。n毛細管柱毛細管柱 n=10n=105 5-10-106 6， H H0.5mm0.5mm 61 4）有效塔板數和有效塔板高度 由于死時間t M包含在tR中，而t M并不參加柱內的分配，所以理論塔板數并不能真正反映色譜柱分離效能的好壞。為此，常用有效塔板數或有效塔板高度作為衡量柱效能的指標。2212)(54. 5)(16YtYtnRR有效有效有效nLH/62n例：例： 在柱長為2m的5

26、%的阿皮松柱、柱溫為1000C，記錄紙速度為2.0cm/min的色譜條件下，測定得苯的保留時間為1.5min，半峰寬為0.20cm，求理論塔板數和理論塔板高度。解： n理=5.54（tR/ Y 1/2)232102 . 1)0 . 220. 05 . 1(54. 5mmH7 . 1102 . 120003H理63塔板理論的貢獻： 塔板理論是一種半經驗性理論，它在解釋流出曲線的形狀和計算、評價柱效方面是成功的。 但色譜分離過程不是一個簡單的熱力學分配過程，不能解釋理論塔板數受哪些因素影響以及色譜峰變寬的原因。64 -影響柱效的因素1）做出了與實際不相符的假設 忽略了組分在兩相中傳質和擴散的動力學

27、過程2）只定性給出塔板高度的概念，卻無法解釋板高的影響因素3）排除了一個重要參數流動相的線速度u u ，因而無法解釋柱效與流速的關系，更無法提出降低板高、提高柱效的的途徑。65 吸收了塔板理論的成果塔板高度H的概念和內涵。 并從動力學角度較好地解釋了影響柱效的因素，并指出，組分在柱內運行的多路徑、濃度梯度造成的組分在柱內運行的多路徑、濃度梯度造成的分子擴散和組分在氣液兩相間的質量傳遞不能瞬間達分子擴散和組分在氣液兩相間的質量傳遞不能瞬間達到平衡到平衡，是造成色譜峰擴張、使柱效能下降的原因。 將色譜過程用隨機模型描述，可得影響板高的三因素：66式中u u為載氣的平均線速度，cm/s; A-渦流擴

28、散項； B-縱向擴散項系數； C-傳質阻力項系數； 皆為條件常數。uCuBAH/6768 由該圖可見，曲線最低點所對應的板高H最小，即該點對應的柱效最高，此時的流速稱為最佳流速， u u最佳。69uBAHCuuu/項可忽略，最佳uCAHuBuu項可忽略，最佳/減小減小A、B、C三項可提高柱效；三項可提高柱效；A、B、C三項各與哪些因素有關？三項各與哪些因素有關？70 (eddy diffusion) 在填充柱色譜中，由于試樣組分的分子通過填充物的不規則空隙時，其流動方向不斷的改變，在氣相中形成類似于渦流的流動。路徑的長短也就產生差異，因而引起色譜峰形的擴張。變寬的程度由下式決定：dpA2填充不

29、規則因子填充顆粒直徑dp71 使用粒度細而均勻的填料，且填充均勻，是減小渦流擴散、提高柱效的有效辦法；注：注：顆粒太小，會使柱壓過高且不易填充均勻v 填充柱60 -100目v 空心毛細管柱 A=0，n理較大72 當試樣中的某組分隨載氣在柱中前進時，組分分子將產生縱向擴散，即沿沿著色譜柱軸向的擴散運動著色譜柱軸向的擴散運動。組分在固定相中被流動相以“塞子”的形式向前推動、在塞子的兩側產生濃度差，擴散必然產生。 73 B=2.r.Dg 式中，r 是填充柱內氣體擴散路徑彎曲程度的因數，物理意義是由于固定相的存在，使分子不能自由擴散，從而使擴散程度降低。 毛細柱 r = 1(不彎曲） ; 填充柱 r

30、1 。 Dg是組分在氣相中的擴散系數，單位為cm2.s-1. 除與組分性質有關外，還與載氣的性質、柱溫等因素有關。74 擴散系數：擴散系數： Dg (M載氣載氣)-1/2 ； M載氣載氣，B值值。 因此，為了減小分子擴散項，可使用分子質量較大的載氣，或控制較低的柱溫和控制較高的線速度。75 傳質阻力系數傳質阻力系數C包括氣相傳質阻力系數包括氣相傳質阻力系數Cg和液相和液相傳質阻力系數傳質阻力系數C l, 即即C=Cg+ C l 氣相傳質過程是指試樣在氣相和氣液界面上的傳質氣相傳質過程是指試樣在氣相和氣液界面上的傳質。采用粒度小的填充物和小分子量載氣，可減小采用粒度小的填充物和小分子量載氣，可減

31、小Cg。76 液相傳質過程是指組分從固定相的氣液界面移動到液相內部，達到分配平衡，又返回到氣液界面的過程。 由于阻力的存在，使試樣在兩相界面上不能瞬間達到分配平衡，使分離效率下降，峰形擴寬。 降低液膜厚度，適當提高柱溫，可減小Cl.77 78五、五、 分離度分離度 塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質對的塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質對的實際分離程度。實際分離程度。怎樣才能定量描述呢79分離度的定義分離度的定義：相鄰兩組分的保留時間之差與兩峰底寬度加和之半的比值。R R=0.8=0.8：兩峰的分離程度可達：兩峰的分離程度可達89%89%；R R=1.0=1.0：分離程度：分離程度98%98%；R R=1.5=1.5：達：達99.7%99.7%（相鄰兩峰完全分離的標志）。（相鄰兩峰完全分離的標志）。)(699. 1)(2)(2)1(2/1)2(2/1)1()2()1()2()1()2(YYttttRRRRRYY80假設假設Y(2)=Y(1)=Y（相