1、生物化學課程期末論文分子伴侶的研究進展孫杰 11041101212011/12/9分子伴侶的研究進展摘要：分子伴侶能結合和穩定另一種蛋白質的不穩定構象,促進新生多肽鏈的正確折疊, 因而在輔助蛋白質復性以及免疫保護等方面有很重要的作用。HSP70分子伴侶能夠幫助細胞內新生蛋白的折疊和跨膜運輸、蛋白質多聚體結構的裝配和解裝配,并能在脅迫下維持蛋白質的特殊構象, 防止未折疊的蛋白質變性和使聚集的蛋白質溶解復性。關鍵詞：蛋白質折疊；分子伴侶；熱休克蛋白1.蛋白質折疊一個有活性的蛋白質分子不但有特定的氨基酸序列，還處于特定的由氨基酸序列決定的三維空間結構。根據分子生物學的中心法則，生命的遺傳信息在核內從

2、DNA轉錄到RNA在細胞質的核糖體上翻譯成蛋白質多肽鏈的氨基酸序列，實際上這只是合成出了新生肽鏈但還不是蛋白質，這種新生肽鏈必須經歷一系列極其復雜的折疊過程，這里的“折疊”不僅指肽鏈在空間的盤旋卷曲，而是包括廣義的新生肽鏈的整個成熟過程，包括化學修飾、跨膜轉運、亞基組裝、水解激活等等。2.蛋白質折疊研究的新概念20世紀60年代nfinsen根據還原變性的牛胰核糖核酸酶在去除變性劑和還原劑后,不需要任何其他物質的幫助能夠自發地形成正確的4對二硫鍵，重新折疊成天然的三維結構并恢復幾乎全部生物活性的實驗，提出“多肽鏈的氨基酸序列包含了形成其熱力學上穩定的天然構象所必需的全部信息”或者說“一級結構決定

3、高級結構”的著名論斷。相對于體外蛋白質折疊研究，細胞內新生肽鏈的成熟實際上是在較高的溫度、較高的蛋白濃度而又十分擁擠的環境中，以極快的速度和極高的保真度在進行著。一句話，以極高的效率在進行著。新的觀點認為，細胞內新生肽折疊和成熟為功能蛋白，一般說來是需要幫助的，而不都是能自發進行而完成的。幫助新生肽折疊的生物大分子主要是蛋白質，它分為兩大類:一類是分子伴侶；一類是催化與折疊直接有關的化學反應的酶，現在又稱“折疊酶”，目前已確定為幫助蛋白質折疊的酶只有2個，一個是蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide isomease,PDI）;另一個是肽基脯氨酰順反異構酶(peptidy pr

4、olyl cis-trans isomerase,PPI)。它們都催化共價的異構反應1。3. 分子伴侶與蛋白質折疊1978年，英國的Laskey發現DNA和組蛋白在體外生理離子強度條件下重組時，必須有細胞核內一種酸性蛋白-核質素(nucleoplasmin)存在時才能成功組裝成核小體，否則就會發生沉淀。Laskey把它叫做“分子伴侶（molecular chaprone）”。蛋白質必須經折疊形成精確的三維結構才具有生物活性。然而在熱應激或其它應激條件下, 蛋白質折疊常常會受到損傷,表現為折疊中間體的疏水區暴露,發生異常反應(如集聚等) ,形成蛋白質聚合物。分子伴侶在蛋白質正確折疊中起著關鍵性作

5、用。 首先, 它可調節性地阻礙多肽鏈集聚; 其次,分子伴侶還具有折疊互補功能,即可使已形成的蛋白質集聚體折疊和恢復其水溶性; 此外, 分子伴侶可以促進折疊錯誤的蛋白質降解。4.分子伴侶的分類24. 1 伴侶素家族( Charperonin, Cpn)Cpn 家族具有獨特的雙層7- 9 元環狀結構的寡聚蛋白( Hemminngwen; cheng 1998) , 它們以依賴ATP 方式促進體內正常和應急條件下蛋白質折疊。Cpns 又可分為兩組: GroEl( Hsp60)家族和Tric家族。GroEl 的Cpn 由雙層7 個亞基形成圓環組成, 每個亞基分子量約為 60ku。它們在體內與一種輔助因

6、子,如E.coli中的GroEs,協同作用幫助蛋白質。這些蛋白質一般是應急反應誘導的,人們對GroE 和GroEs 的結構、 功能及作用機理作了詳細研究。Tric型的Cpn 是由雙層8 或9元組成,亞基分子量約為55k。 該種Cpn 沒有類似的輔助因子。4. 2 熱休克蛋白70家族由于該家族是進化上最保守的蛋白質之一,在應用上具有廣闊的前景, 因此是研究最多的家族。HSP70廣泛分布于細胞核、細胞質、內質網、線粒體和葉綠素等細胞的各個部分, 它作為分子伴侶參與所有細胞內蛋白質的從頭合成和定位、蛋白質的成熟和錯誤折疊蛋白質的降解及調節過程, 因而能夠嚴重地影響生長在正常條件和脅迫條件下生存的細胞

7、功能和代謝過程。4. 3 熱休克蛋白90家族熱休克蛋白90 家族(Hsp 90 family) ,分子量在90ku左右。 Hsp90可以與腦漿中的類固醇激素受體結合, 封閉受體的DNA 結合域,阻礙其對基因轉錄調控區的激活作用, 使之保持在天然的非活性狀態。但Hsp90的結合也使受體保持著對激素配體的高親和力。Hsp還與Ras信號途徑中許多信號分子的折疊與組裝密切相關, 主要是Hsp90的結合與解離導致了這些分子在活性與非活性之間的轉化。4. 4 其它種類的分子伴侶包括核質素、T 受體結合蛋白(TRAP)、大腸桿菌的SecB和觸發因子(trigger factor)及PapD、噬菌體編碼的支架

8、蛋白(scaf folding proteins)等。它們相應的功能如表一所示。表1 分子伴侶及其功能（引自BBRC,1997,238,687-692）名稱生物功能核質素熱休克蛋白60大腸桿菌CroERubisco亞基結合蛋白真核細胞胞質TCPI熱休克蛋白70大腸桿菌DnaK線粒體Hsp70,酵母SSCI熱休克蛋白90細胞質Hsp90酵母HSP82DnaJCrpESecB信號識別粒子前導肽PapDLim卵中核小體組裝和拆卸新生肽鏈轉運和折疊新生肽鏈轉運和折疊激素受體蛋白折疊和Hsp70及CrpE協同作用和Hsp70及DnaJ協同作用細菌多肽轉運新生肽鏈轉運蛋白水解酶折疊細菌鞭毛組裝細菌脂肪酶折

9、疊5.HSP70 分子伴侶系統研究進展HSP70 家族是進化史上最保守的蛋白質之一。它的家族成員包括四個: grp78、mtp70、hsc70及hsp70。前三種是在正常條件下產生的, 而hsp70是由應激誘導產生。HSP70同疏水的肽類有高親和力, 并且隨著ATP的水解而增高3。HSP70與多肽之間的可逆作用在蛋白質的折疊、轉運、錯誤折疊多肽的降解及其調控過程中有重要作用。HSP70之所以能起如此重要的作用是由它的結構決定的。5. 1 HSP70 的結構HSP70結構由兩部分組成,一部分主要由一個N端高度保守的44ku的三磷酸腺苷酶(ATPase) 功能域(ATPbinding domain

10、) ; 另一部分由一個分子質量為25ku的C端區域組成。N端ATPase 功能域的結構類似于凝聚素和己糖激酶,主要由兩個大的球形亞功能域I和II 組成,其間被一個深的中央裂縫分開,并通過2個交叉的螺旋相連接;亞功能域和連接的螺旋和裂縫的底部形成一個核苷酸及所需的Mg2+和 K+的結合袋,核苷酸經過與兩個磷酸結合環和一個疏水腺苷的相互作用而定位在活性部位4,并與HSC70側鏈結合的Mg2+相聯系。C端區域又分一個保守的15ku的多肽的結構功能域和一個不保守的靠近C 端的10ku可變區功能域, Zhu5等在 1996 年研究表明 Dnak( HSC70)底物結合功能域和端分可變區域重組片段的結構主

11、要由兩部分組成,第一部(N 端) 折疊或一個緊密的-三明治(- sandwich)結構。第二部分( C 端)由5個螺旋組成,形成一個松弛的螺旋結構（如圖1）。松弛構象的多肽結合在由-三明治結構形成的底物結合通道中, 而螺旋部分位于多肽結合單位之上, 象一個蓋子覆蓋在結合通道上面,而不與底物直接接觸,所以能阻止結合底物的逃脫。圖 1DnaK C 端區域拓撲結構示意圖Fig. 1Topology structure of DnaK C terminal domain5. 2 HSP70 的作用機理HSP70的ATPase活性很弱,活體內它通常可能處于ATP 結合狀態(螺旋蓋子處于開的狀態),在次狀

12、態下,它們不能穩定地結合多肽,可是,如何從事蛋白質折疊反應呢?Hartl6研究表明 HSP70 ATP 的水解反應周期包括 5個步驟(圖2) : A、分子伴侶DnaJ首先暫時與未折疊多肽迅速結合。B、DnaK-ATP 與DnaJ的J功能域通過未確定的 DnaK的結合位點相互作用,然后把蛋白質底物轉移到打開的DnaK-ATP底物結合袋中。即DnaK-ATP從DnaJ-底物復合物中接受多肽。C、DnaJ 與DnaK相互作用促進ATP水解,并使未折疊多肽DnaK復合物穩定地處于ADP結合狀態;然后DnaJ從DnaK-ADP-底物-DnaJ三元復合物解離下來。D、核苷酸交換因子GrpE與DnaK-AD

13、P-底物復合物結合, 引起ADP的釋放。E、ATP 快速與DnaK 結合,螺旋蓋子打開,引起底物和GrpE的釋放, DnaK 恢復到起始狀態。解離的底物將進一步折疊,或重新與DnaJ和DnaK結合或轉移到其他的分子伴侶系統(如GroE) , 完成最后的折疊。圖 2Hsp70 分子伴侶系統作用模式示意圖Fig . 2Structure and function of the Hsp70 system5. 3 HSP70 的功能HSP70 廣泛分布于細胞核、細胞質、內質網、線粒體和葉綠素等細胞的各個部分7, 它作為分子伴侶參與所有細胞內蛋白質的從頭合成和定位、蛋白質的成熟和錯誤折疊蛋白質的降解及調

14、節過程8, 因而能夠嚴重地影響生長在正常條件和脅迫條件下生存的細胞功能和代謝過程。5. 3. 1 脅迫下HSP70 的功能HSP70 在脅迫下的保護功能知道很少。體外實驗表明DnaK 能溶解某些熱變性蛋白的聚集物,但是活體內分子伴侶在脅迫下的保護機理則主要是通過與脅迫誘導的未折疊底物多肽的結合而阻止其聚集變性。如轉化的E.coli細胞放在42,其中表達的螢火蟲螢光素酶活性喪失,若在此熱脅迫期間細胞內有DnaK、DnaJ和GrpE功能多肽存在時, 其酶活性在30時又可以得以恢復,反之則不能恢復9,說明分子伴侶在脅迫下能夠具有保護酶結構的作用。5. 3. 2 在蛋白質跨膜運輸中的作用在細胞中蛋白質

15、在核糖體上合成。數以萬計的蛋白質合成以后分送到細胞各部分(細胞液、細胞核、線粒體、內質網、溶酶體等等)，有的則分泌至胞外。 由于細胞各部分都有特定的蛋白質組分,因此合成的蛋白質必須定向地、 準確無誤地進行運送,才能保證細胞活動的正常進行10。HSP70不僅能幫助線粒體和內質網新輸入蛋白質的折疊, 而且參與蛋白質的移位過程, 實驗證明HSP70用一種類似于棘輪的分子機制促進蛋白質移位。116.分子伴侶應用前景6. 1 輔助蛋白質復性重組DNA 技術為大規模生產目標蛋白提供了嶄新的途徑。但人們在分離純化基因工程表達產物時卻遇到了意想不到的困難: 很多利用大腸桿菌為宿主細胞的外源基因表達產物如尿激酶

16、、人胰島素、人生長激素、白介素-6、人-干擾素等,不僅不能分泌到細胞外,反而在細胞內聚集成沒有生物活性的直徑約為0.13.0m 的固體顆粒包含體。 12這些基因表達產物的一級結構(即氨基酸序列)雖然正確, 而其立體結構是錯誤的,所以沒有生物活性。 因此,為獲得天然狀態的目標產物,必須在分離回收包含體后,溶解包含體并設法使其中的目標蛋白質恢復應有的天然構象和活性。分子伴侶幫助變性蛋白質正確折疊的功能為解決上述困難提供了可能。有些學者已成功地利用分子伴侶在體內和體外輔助蛋白質復性。但分子伴侶在實際運用中尚存在費用高并需要與復性蛋白質分離等缺點,因此研究開發分子伴侶的重復利用性及穩定性是實現其應用的

17、關鍵。董曉燕等利用固定化分子伴侶GroE,研究了其對變性溶菌酶的復性作用,解決了分子伴侶的重復利用問題。13Teshima 等利用固定化分子伴侶,在體外輔助了淀粉酶、碳酸酐酶、DNA酶的折疊復性。14還有報道利用“小分子伴侶”對目標蛋白質進行復性。 15它們能有效的促進親環蛋白A、硫氰酸酶以及芽孢桿菌RNA 酶的復性。由于小分子伴侶分子較小,更適合于固定化,且不需另加復性輔助因子(如GroES 和ATP等) , 因此具有很大的應用前景。6. 2 分子伴侶的免疫保護作用分子伴侶不僅是胞內蛋白質折疊、組裝與轉運的幫助蛋白, 更令人驚奇的是它還可以成為感染性疾病中的免疫優勢抗原,激發宿主體內的體液免

18、疫反應和T細胞介導的細胞免疫反應,證實在細胞或寄生蟲感染中具有免疫保護作用。16這說明分子伴侶有可能用作疫苗,來抵抗微生物的感染, 并用來治療腫瘤和自身免疫疾病17。用一個96ku的腫瘤相關分子伴侶免疫腫瘤病人,已進入一期臨床實驗。 18動物疾病中的胰島素依賴型糖尿病、風濕病等可被分子伴侶cpn60抑制,可能是cpn60-反應性T淋巴細胞起了作用。生理情況下,誘導熱休克蛋白Hsp70 等的過度表達, 能使機體具有更高的缺血耐受能力, 減少急性成人呼吸窘迫癥造成的器官損害。6. 3 其他方面由于環境中無機及有機污染物對 Hsp70有誘導作用, 因此可通過測定植物及動物體內的Hsp70 水平來監測

19、環境污染情況。19另外, 研究表明, 隨著年齡增加, 人體血漿中的 Hsp60 和Hsp70明顯減少。20因此可通過測量血漿中熱休克蛋白和抗熱休克蛋白的抗體的水平來估計人體老化程度。7. 展望盡管分子伴侶系統的結構和功能方面的研究取得了很大的進展,但是DnaJ-likeHSC70 提供蛋白質底物的機理,特別是對真核生物HSC70而言還不清楚;另外ATP 與HSP70ATPase功能域的結合和水解引起的底物結合功能域構象發生變化的機理仍然不知道。搞清楚這些問題,對于闡明蛋白質的折疊、定位及跨膜運輸機理和分子伴侶的實際應用有重要意義。另外,研究開發分子伴侶的重復利用性及穩定性是實現分子伴侶實際應用

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