1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定實驗目的：學習在實現(xiàn) DNA體外重組過程中，正確選擇合適的載體和限制性內(nèi)切酶并能對限制性核酸內(nèi)切酶對載體和目的 DNA進行切割，產(chǎn)生利于連接的合適末端。學習設計構(gòu)建重組 DNA分子的基本方法，掌握載體和外源目的DNA酶切的操作。學習利用T4DNA連接酶把酶切后的載體片段和外源目的DNA片段連接起來，構(gòu)建體外DNA分子的技術(shù)，了解并掌握幾種常用的連接方式。掌握利用Cacl2感受態(tài)細胞的方法。學習掌握熱擊法轉(zhuǎn)化 E.coli的原理和方法。掌握a互補篩選法和PCR檢測法篩選重組子的方法。并鑒定體外導入目的 DNA片段的大小。學習和掌握PCR反應的基本原理和操作技術(shù)，了

2、解引物設計的基本要求。實驗原理：外源DNA與載體分子的連接即為 DNA重組技術(shù)，這樣重新組合的DNA分子叫做重組子。重組的DNA分子式在DNA連接酶的作用下，有 Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分 別經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的載體分子和外源DNA分子連接起來。將重組質(zhì)粒導入感受態(tài)細胞中，將轉(zhuǎn)化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以通過a互補篩選法篩選出重組子，并可通 過酶切電泳及PCR檢驗的方法進行重組子的鑒定。重組子的構(gòu)建酶切時首先要了解目的基因的酶切圖譜，選用的限制性內(nèi)切酶不能目的基因內(nèi)部有專一的識別位點，否則當用一種或兩種限制性內(nèi)切酶切割外源工體DNA時不能得到完整的目的基因。其次要選擇具

3、有相應的單一酶切位點質(zhì)粒或者噬菌體載體分子。常用的酶切方法有雙酶切法DNA片段，酶和單酶切法兩種。本實驗采用單酶切法，即只用一種限制性內(nèi)切酶切割目的 切后的片段兩端將產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端，再選用同樣的限制性內(nèi)切酶處理載體。在構(gòu)建重組子時，除了形成正常的重組子外，還可能出現(xiàn)目的DNA片段以相反方向插入載體分子中，或目的DNA串聯(lián)后再插入載體分子中，甚至出現(xiàn)載體分子自連，重新環(huán)化的現(xiàn)象。單酶切法簡單易行單是后期篩選工作比較復雜。各種限制性內(nèi)切酶都有去最佳反應條件，最主要的因素是反應溫度和緩沖液的組成，在雙酶切體系中，限制性內(nèi)切酶在使用時應遵循“先低鹽后高鹽，先低溫后高溫”的原則進行反應。（要

4、達到高效率的連接，必須酶切完全，酶切的DNA數(shù)量要適當。另外，酶切反應的規(guī)模也取決于需要酶切的 DNA的量，以及相應的所需酶的量。可以適當增加酶的用量，但是最 高不能超過反應總體積的 10%，因為限制性核酸內(nèi)切酶一般是保存在50%甘油的緩沖液中，如果酶切反應體系中甘油的含量超過5%，就會抑制酶的活性。）連接反應總是緊跟酶切反應，外源DNA片段與載體分子連接的方法即DNA分子體外重組技術(shù)主要依賴限制性核算內(nèi)切酶和DNA連接酶催化完成的。 DNA連接酶催化兩雙鏈 DNA片段相鄰的5'磷酸和3 -OH間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的 DNA連接酶是來自T4 噬菌體的T4 DNA連接酶，

5、它可以連接黏性末端和平末端。連接反應時，載體DNA和外源DNA的摩爾數(shù)之比控制在 1:（ 13 ）之間，可以有效地解決 DNA多拷貝插入的現(xiàn)象。反應 溫度介于酶作用速率和末端結(jié)合速率之間，一般是16 C,用常用的連接時間為 12-16h。感受態(tài)細胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化構(gòu)建好的重組 DNA轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞中進行表達的現(xiàn)象就是轉(zhuǎn)化。能進行轉(zhuǎn)化的受體細胞必 須是感受態(tài)細胞，即受體細胞最容易接受外源DNA片段實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)，它決定于受體菌的遺傳特性，同時與菌齡、外界環(huán)境等因素有關(guān)。人工轉(zhuǎn)化是通過人為誘導的方法使細 胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導入細胞內(nèi)，該過程與細菌自身的遺傳控制無關(guān),常用熱

6、擊法，電穿孔法等。能否實現(xiàn)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化還與受體細胞的遺傳特性有關(guān)，所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)的缺陷變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。目前常用的感受態(tài)細胞制備方法有CaCI2法，制備好的感受態(tài)細胞可以加入終濃度為15%的無菌甘油，-70 C可保存半年至一年。經(jīng)過CaCI2處理的細胞細胞膜通透性增加，允許外源DNA分子進入。在低溫下，將攜帶有外源DNA片段的載體與感受態(tài)細胞混合，經(jīng)過熱擊或電穿孔技術(shù)，使載體分子進入細胞。進入受體細胞的外源DNA分子通過復制、表達，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將這些轉(zhuǎn)化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出重組 子。本實驗以E.coli DH

7、 5 a菌株為受體細胞，用 CaCI2處理，使其處于感受態(tài)，然后將重組 后的PUC19質(zhì)粒在42 C下熱擊90s，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。重組子的篩選鑒定重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞后， 并非所有的受體細胞都能被導入重組DNA分子，一般僅有少數(shù)重組DNA分子能進入受體細胞， 同時也只有極少數(shù)的受體細胞在吸納重組DNA分子之后能良好增殖。并且它們是與其他大量未被轉(zhuǎn)化的受體菌細胞混雜在一起。再者，在這些被轉(zhuǎn)化 的受體細胞中，除部分含有我們所期待的重組DNA分子外，另外一些還可能是由于載體自身或一個載體與多個外源 DNA片段形成非期待重組 DNA分子導入所致。因此必須使用各種 篩選及鑒定手段區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，并從轉(zhuǎn)

8、化的細胞群體中分理出帶有目的基因的重組 子。本實驗中采用的方法是平板篩選法電泳篩選法及PCR檢測方法。抗藥性篩選主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化子的篩選， 而不含重組質(zhì)粒 DNA分子的受體菌則不能存活，a互補篩選法是根據(jù)菌落顏色篩選含有充足質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒PUC19攜帶有氨芐青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨芐青霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化子。沒有導入質(zhì)粒PUC19的受體細胞，在含有氨芐青霉素的平板上不生長。質(zhì)粒PUC19進入E.coli DH 5 a后，通過a-互補作用，形成完整的B -半乳糖苷酶。在麥康凱培養(yǎng)基平板上，轉(zhuǎn)化子利用B-半乳糖苷酶分含質(zhì)粒的E.coli DH 5 a,沒有伊半乳糖苷酶

9、活性，不能利用培養(yǎng)集中的乳糖產(chǎn)生有機酸，而 是利用培養(yǎng)集中的有機碳源，不使培養(yǎng)基pH降低，在不含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上形成白色菌落。重組后的載體DNA因為目的基因的插入位點在PUC19乳糖利用基因內(nèi)部，不能形成a-互補作用，所以也不能利用培養(yǎng)集中的乳糖產(chǎn)生有機酸，在含有氨芐青霉素的麥 康凱培養(yǎng)基上形成白色菌落。挑選在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長的白色菌落，通過擴增培養(yǎng)。因為許多菌落存在假陽性情況，在氨芐青霉素培養(yǎng)基上的白色菌落可能是導入的重組載體DNA菌落，也可能是載體自連后發(fā)生突變的菌落，所以還要鑒定轉(zhuǎn)化子中重組質(zhì)粒DNA分子的大小，可將重組的載體DNA提取出來，進行后續(xù)的酶切、電泳檢驗。也

10、以提取的重組質(zhì)粒為模板，利用現(xiàn)有的引物，進行那個PCR擴增，檢測個噢偶見的質(zhì)粒是否是所期望的重組質(zhì)粒。PCR技術(shù)PCR ( Polymerase chain reaction )即聚合酶鏈式反應，其原理類似于DNA的體內(nèi)復制，又叫做“體外基因擴增”反應體系包括：模板 DNA、寡核苷酸引物、Mg2+ , 4種脫氧核糖核酸(dNTP )、DNA聚合酶和合適的緩沖體系。反應基本程序包括DNA變性、引物復性及引物延伸三個基本過程。這三個反應構(gòu)成一個循環(huán)，反復進行。每一輪循環(huán)擴增的產(chǎn)物可作為 下一輪擴增反應的模板。 理論上每一輪循環(huán)可使 DNA數(shù)量增加一倍，反復30次，特異DNA 序列片段以指數(shù)方式可擴

11、增105106。通過此技術(shù)可以使非常微量的DNA產(chǎn)生大量的PCR產(chǎn)物，因此這個技術(shù)是一項在體外大量生產(chǎn)目的基因的技術(shù)。現(xiàn)在普遍通用的是一種從水生嗜熱桿菌中提取的Taq DNA聚合酶，而且大大提高了擴增片段的特異性、靈敏性和擴增效率。 反應中用的引物有兩段， 一條稱為上游引物或者正向引物，一條稱為下游引物或者反向引物。弓I物的設計十分重要，在設計時應遵循以下原則：長度 般為18到24個堿基；G+C的百分含量在40%60% ；單條引物內(nèi)部避免含有二級結(jié)構(gòu)， 避 免形成引物二聚體；最好以 1到2個G或C堿基開始或結(jié)束；引物的 5'端可以被修飾，但 是3 '端絕對不能進行任何修飾，而且

12、引物的 3'端要避開密碼子的第三位。模板的濃度不能太大，dNTP的濃度為2.5mmol/L，金屬離子的濃度為 1.5mmol/L，緩沖液為pH為7.28.0的Tris HCl 溶液。實驗材料：菌株：E.coli DH 5 a培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基（加入氨芐青霉素）試劑材料：酶切反應：（DNA PUC19 質(zhì)粒，酶切10 ©uffer , Hi nd川,重蒸水，入DNA。）連接反應：（酶切后的DNA PUC19 質(zhì)粒和入DNA，連接10 buffer , T4連接酶，重蒸水。）感受態(tài)細胞的制備：（0.1M CaCI2 ）轉(zhuǎn)化：（連接液和感受態(tài)細胞，0.1M CaCl2

13、，冰塊。）重組菌的挑選、檢驗：試劑盒（含有Rnase A的溶液I,溶液n,溶液川，HB buffer,DNA washingbuffer, elution buffer），酶切后的 DNA PUC19 質(zhì)粒，試劑盒抽提的 DNA，酶切 10 xbuffer ,Hind川,重蒸水，瓊脂糖，TAE緩沖液。上樣緩沖液，EB染液。PCR檢測：10 XPCR buffer,dNTP,模板，引物1，引物2，水，Taq DNA聚合酶，瓊脂糖，TAE、溴化乙錠（EB）4.儀器器材： 20、200、1000ul的槍和槍尖，1.5 ml的Ep管，恒溫培養(yǎng)箱，水浴鍋，平板，三角瓶，試PCR擴增儀管，接種環(huán)，牙簽，酒

14、精燈，火柴，冰箱，離心機，電泳槽，紫外儀,試驗流程載體與外源片段的酶切t連接t感受態(tài)細胞的制備t質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與重組子的篩選t重組子的挑取與復證t重組質(zhì)粒的提取與電泳檢測t PCR檢測注意事項：本實驗屬于微量操作，用量極少的步驟必須嚴格注意吸取量的準確性并確保樣品全部加入反 應體系中。實驗中所用塑料器材都必須是新的，并且經(jīng)過高溫滅菌，操作時打開使用，操作過程中要注意環(huán)境干凈，戴手套操作，盡量減少走動，縮短Ep管開蓋的時間。不論是酶切還是連接反應，加樣的順序應該是，先加重蒸水，其次是緩沖液和DNA，最后加酶。且前幾步要把樣品加到管底的側(cè)壁上，加完后用力將其甩到管底，而酶液要在加入前從-20 C的冰箱取

15、出，酶管放置冰上，取酶液時吸頭應從表面吸取，防止由于插入過深而使吸頭外壁沾染過多的酶液。取出的酶液應立即加入反應混合液的液面以下，并充分混勻。Ep管的蓋子應蓋緊，防止水浴過程中水汽進入管內(nèi)，并做好標記以防樣品混淆。轉(zhuǎn)化過程要防止雜菌和其他DNA的污染，整個操作過程應在無菌條件下進行。電泳時使用的緩沖液最好是現(xiàn)配現(xiàn)用，以免影響電泳效果。制備凝膠時，應避免瓊脂糖溶液在微波爐里加熱時間過長，否則溶液將會暴沸蒸發(fā)，影響瓊脂糖濃度。制膠時要除去氣泡。拔梳子時要特別小心，以防凝膠與支持物脫離。上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞康哪z刺穿。也不要快速擠出吸頭內(nèi)的樣 品，避免擠出的空氣將樣品沖出樣品

16、孔。溴化乙錠是一種強烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的溶液時，應帶上乳膠手套進行操作。勿將溶液滴灑在臺面上，實驗結(jié)束后用水徹底沖洗干凈。紫外線對眼睛和皮膚均有傷害，對眼睛尤甚。觀察電泳條帶時要確保紫外光源得到適當遮蔽，并應戴好目鏡或眼罩，避免皮膚直接暴露在紫外線下。實驗中加樣后應及時更換吸頭，以避免試劑的污染。PCR反應高度靈敏，應設法避免污染，如戴一次性手套操作，使用一次性PCR管和吸頭,反應加樣區(qū)應與 DNA模板制備區(qū)及 PCR產(chǎn)物電泳檢測區(qū)分開。PCR管單加樣時，對于非常微量的樣品一定將樣品加在管壁上或者液體中，防止漏樣。實際操作時，為了防止少加樣，可以保存每次用過的槍尖，通過數(shù)槍尖

17、知道自己加到哪一步 了。實驗結(jié)果與分析1、酶切電泳圖的結(jié)果及分析123456789101112 1314 1516171817,18泳道分別是標準入DNA酶切和自己的入DNA酶切后的產(chǎn)物的條帶。15泳道為 marker , 16泳道是未酶切的入DNA的條帶。12, 13,14泳道分別是pUC19和商品pUC19 酶切。1泳道為我們的樣品，是經(jīng)酶切過的 DNA PUC19 質(zhì)粒，從圖中可以看出只有有一條主帶，這條是被Hind III切開的線性 DNA PUC19 質(zhì)粒，與DNA marker比較查資料可知分子量為2322，且可根據(jù)亮度看出含量不是很高。但是可以判斷出我們組的載體質(zhì)粒PUC19酶切

18、很徹底。其他組的條帶有些下面還有一條很淺的帶是超螺旋DNA PUC19質(zhì)粒，即沒有被切開的質(zhì)粒，分子量為 2027。2重組子篩選結(jié)果轉(zhuǎn)化后，10個平板的菌落狀況：順序平板現(xiàn)象解釋川（感受態(tài)細胞）麥氏Ap-培養(yǎng)基呈橙紅色，菌落DN5 a是氨芐敏感型，不能在AP+50ul布滿平板呈白色，無單的平板上生長菌落川（感受態(tài)細胞）麥氏培養(yǎng)基呈紅色，無菌落50ulAP+生長n （感受態(tài)細胞麥氏生長了較多的單菌洛，Puc19是氨芐抗性，導入受體細+puc19 )AP+菌落呈現(xiàn)紫紅色胞，與受體DH5 a發(fā)生a互補作用50ul分解乳酸，培養(yǎng)基 PH下降，指示劑變紅，轉(zhuǎn)化子菌落變紅1（感受態(tài)細胞+連接麥氏既有白色單

19、菌落又有紅部分轉(zhuǎn)化子導入的是發(fā)生自連的DNA）50ulAP+色單菌落。接種的體積 越多，但菌洛數(shù)量越多。完整的PUC19質(zhì)粒可發(fā)生a互補 作用使菌落變紅，部分轉(zhuǎn)化子導 入了重組質(zhì)粒（即重組子），載體 多克隆位點插入外源片段后不能 利用乳糖而是利用其他營養(yǎng)物質(zhì) 使菌落呈現(xiàn)白色。I100ul麥氏AP+I150ul麥氏AP+I200ul麥氏AP+3重組質(zhì)粒電泳結(jié)果J J141234567891011121315Re-pUC19 電泳檢測：（L1-2 ： lamda/HIII , L3-14:1-6 組樣品各 2 個；L15 :空載體）marker對比帶的位置可以比較 DNA片段的大小。載體對照可以看

20、出，我們篩選到的重組質(zhì)粒中插入了外源DNA片段。重組質(zhì)粒與15泳道的空中分別插入了較小的基因片段（14 ）和較大的基因片段（13），對照DNA marker lamda/HHI ，我們推測載體PUC19中插入的片段可能分別是125bp和6557bp大小的片段。結(jié)果還有待于進一步酶切驗證和PCR檢測。4酶切驗證電泳結(jié)果F圖分別是經(jīng)過試劑盒提取的插入大片段和小片段的重組質(zhì)粒的酶切驗證電泳圖。Re-pUC19 的酶切鑒定大片段（1-11:各組樣品；L12 : lamda/HIII ; L13 : pUC19/III ）123 4 5 6 7 89 1011 121314Re-pUC19的酶切鑒定小片

21、段(1-12各組樣品；13 :pUC19 ；14 :DL2000plus ；15-25 :各組樣品）（DL2000 plus 的大小分別為：5000,3000,2000,1000,750,500,250,100）第一張圖中4泳道是我們組插入大片段的重組質(zhì)粒酶切電泳條帶，第二張圖中的7,8泳道分別是我們的插入小片段的重組質(zhì)粒的酶切前后的電泳條帶，其中酶切前的電泳結(jié)果作為 對照。從圖中可以看出插入大片段的重組質(zhì)粒酶切后（4號泳道），上面有緊鄰的兩條帶，與 DNAmarker lamda/HHI比較可知其分子量大小在6557bp左右，與上一步實驗中的推測相符合。因此可以判定此重組質(zhì)粒中插入了6557bp大小的DNA片段。理論上上方應該只