1、HPLC同時測定何首烏中5種成分及指紋圖譜的建立HPLC同時測定何首烏中5種成分及指紋圖譜的建立5304202106-0075-07 Abstract： Objective To establish an HPLC method to determine the contents of five kinds of index components in Polygoni Multiflori Radix from different producing areas; To establish HPLC fingerprint analysis method of Polygoni Multif

2、lori Radix. Methods Agilent Eclipse XDB-C18 column 4.6 mm 250 mm， 5 m was used， with acetonitrile - 0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase， gradient elution， to determine the contents of galloyl glucose， gallic acid， stilbene glycoside， emodin， and emodin methyl ether in Polygoni

3、Multiflori Radix， and SPSS19.0 software was used to conduct clustering analysis for the data. HPLC fingerprints of Polygoni Multiflori Radix were established and analyzed. Results The injection volume of five index components of Polygoni Multiflori Radix showed a good linear relationship with the pe

4、ak area integral value in the linear range， and the correlation coefficient were all higher than 0.999 4. The results of the content determination showed that the contents of galloyl glucose， gallic acid， stilbene glycoside， and emodin methyl ether in Polygoni Multiflori Radix from Fuyang， Anhui Pro

5、vince was the highest 0.048 9%， 0.036 1%， 3.179 9%， 0.551 2%， respectively， and the content of emodin of Polygoni Multiflori Radix from Anshun， Guizhou Province was the highest 0.423 8%. The average total content of index components of sample from Fuyang， Anhui Province was the highest 3.966 6%， fol

6、lowed by samples from Bozhou， Anhui Province 2.769 8%， Guizhou Province 2.469 4% and Sichuan Province 2.306 3%. The fingerprints 何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的枯燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便成效，用于瘡癰、風疹瘙癢、久瘧體虛、腸燥便秘等1。目前市售何首烏存在偽品、摻偽、染色等問題，影響何首烏的臨床應用2，因此，制定相應的質量操縱標準十分關鍵。何首烏主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類等化合物3-11。本討論以二苯乙烯

7、苷、大黃素、大黃素甲醚、五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸為指標成分，接受HPLC對不同產地的何首烏樣品進行含量測定，比較不同產地何首烏之間的差異，并建立HPLC指紋圖譜分析方法，為江蘇省中醫院何首烏藥材基地進行標準化、規范化種植與加工提供數據支持，為藥監部門對何首烏進行質量監控提供參考方法，并為2021年版中華RM共和國藥典何首烏質量標準的修訂提供參考。 2.3.4 參照峰的選擇2.3.5 周密度試驗 取何首烏樣品S92.0 g，周密稱定，按“2.1.3項下方法制備供試品溶液，避光、室溫放置，按“2.1.1項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰面積，以二苯乙烯苷為參照峰計算各共有峰的相對峰面積，其RS

8、D均小于4.36%。接受中藥色譜指紋圖譜相像度評價系統2021版進行分析，各樣品色譜圖之間的相像度為1，符合指紋圖譜技術要求。2.3.6 穩定性試驗 取何首烏樣品S92.0 g，周密稱定，按“2.1.3項下方法制備供試品溶液，避光、室溫放置，按“2.1.1項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣，記錄色譜峰面積，計算各共有峰的相對峰面積，其RSD均小于4.71%。接受中藥色譜指紋圖譜相像度評價系統2021版軟件進行分析，各樣品色譜圖之間的相像度為1，說明供試品溶液在12 h內穩定性良好。2.3.7 指紋圖譜建立及相像度評價 取14批何首烏樣品粉末，按“2.1.3項下方法制備供

9、試品溶液，按“2.1.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，導入中藥色譜指紋圖譜相像度評價系統2021版軟件進行分析。以S1樣品圖譜作為參照圖譜，接受多點校正方法匹配色譜圖，通過中位數法生成對比圖譜，共確定了18個共有峰。接受對比品對比，確定了2、4、7、17、18號峰分別為五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚見圖3、圖4。接受中位數法導出14份樣品的共有模式與相像度評價見表7、表8。14份樣品中有11份相像度大于0.90，質量相對穩定;其中S9、S10、S12相像度低于0.90，質量稍差。4 商量 在流淌相選擇上，本試驗比較了甲醇-水與乙腈-0.1%磷酸水溶液5，結果當流淌性

10、為乙腈-0.1%磷酸水溶液時，各成分峰形及分別度較好，應選用乙腈- 0.1 %磷酸水溶液作為流淌相。 在供試品溶液制備中，本試驗比較了70%、80%、90%、100%甲醇作為提取溶劑在相同環境條件下的提取效果，通過進樣分析，比較各成分的峰面積，發覺90%甲醇作為提取溶劑時效果最正確，應選用90%甲醇作為提取溶劑。 由指標成分含量測定結果可知，何首烏主要含有二苯乙烯苷類、蒽醌類，其中，蒽醌類化合物主要為大黃素和大黃素甲醚，而大黃酸、大黃酚和蘆薈大黃素含量極低甚至難以測出;此外，何首烏中還含有少量五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸。由表5可知，貴州、安徽、四川產地的何首烏樣品中的二苯乙烯苷、大黃素、大黃素

11、甲醚含量均符合2021年版中華RM共和國藥典規定;云南產地何首烏樣品中未檢測出二苯乙烯苷類及蒽醌類成分，不符合藥典規定。由圖1、圖2可以看出，云南產地何首烏樣品峰形與其他產地的何首烏樣品存在顯著差異，推想云南產地的何首烏可能是其同屬近源物種。安徽阜陽的何首烏樣品中五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、二苯乙烯苷及大黃素甲醚的含量最高分別為0.048 9%、0.036 1%、3.179 9%、0.551 2%;貴州的何首烏樣品中大黃素含量最高0.423 8%。指標性成分平均總含量最高的為安徽阜陽樣品3.966 6%，其次為安徽亳州、貴州、四川樣品2.769 8%、2.469 4%、2.306 3%。聚類分

12、析結果說明，不同產地何首烏之間有肯定差異，云南產何首烏與其他產地樣品差異顯著，與含量測定結果相符;安徽產何首烏與四川、貴州樣品差異也較大，四川與貴州樣品接近，可歸為一類，這與各地區地理位置存在肯定相關性。 本試驗建立了何首烏HPLC指紋圖譜，確定了18個共有峰，指認了何首烏中的五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚5個化學成分。通過使用中藥色譜指紋圖譜相像度評價系統軟件分析，14批樣品中有11批相像度0.90，S9、S10、S12相像度0.90，說明大部分何首烏樣品質量較穩定，少數樣品質量有待提高。指紋圖譜的建立有助于優化何首烏的質量掌握方法，可應用于何首烏的質量檢測。 綜上所述，本試驗測定了16批不同產地的何首烏樣品中五沒食子酰葡萄糖、沒食子酸、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚5種指標性成分的含量，通過使用SPSS19.0軟件進行聚類分析，發覺云南產何首烏樣品為同屬近源種，不能作為何首烏藥材使用，且何首烏指標成分含量的分布具有肯定地域性。本試驗接受貴州、四川、安徽何首烏樣品建立了何首烏HPLC指紋圖譜，確定