1、實驗一、動物組織基因組DNA提取一、實驗目的一、實驗目的二、實驗原理二、實驗原理1、核酸的分類、核酸的分類l DNA ( DNA (脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸) ) 主要存在于細胞核的染色體中。主要存在于細胞核的染色體中。 核外也有少量核外也有少量DNADNA，如線粒體，如線粒體DNADNA（mtDNAmtDNA），葉綠體），葉綠體DNADNA（cpDNAcpDNA），質粒），質粒DNADNA。l RNA RNA（核糖核酸）（核糖核酸） 存在于細胞質中，如存在于細胞質中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，外，還

2、有非細胞形式存在的病毒和噬還有非細胞形式存在的病毒和噬 菌菌體，其或只含體，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。核酸的理化性質核酸的理化性質l在細胞內通常與蛋白質結合，以復合物形式存在在細胞內通常與蛋白質結合，以復合物形式存在2、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則l微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機溶劑微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機溶劑l在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩定。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩定。lDNADNA溶液粘度很大，溶液粘度很大，RNARNA的粘度較小的粘度較小l在強大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來在強大離心力的作用下

3、，可以從溶液中沉降下來l分離純化核酸總的原則：分離純化核酸總的原則：2、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則l核酸純化應達到的要求：核酸純化應達到的要求： 核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑有機溶劑和過高和過高濃度的濃度的金屬離子金屬離子； 其它生物大分子的污染應降低到最低程度；其它生物大分子的污染應降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。 應保證核酸一級結構的完整性；應保證核酸一級結構的完整性； 排除其它分子排除其它分子( (蛋白，脂類，多糖類蛋白，脂類，多糖類) )的污染。的污染。l核酸制備時應注意的事項核酸制備時應注意

4、的事項: : 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。 減少化學因素對核酸的降解。減少化學因素對核酸的降解。 減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫 防止核酸的生物降解：排除防止核酸的生物降解：排除核酸酶核酸酶。 排除其它核酸分子的污染，如提取排除其它核酸分子的污染，如提取DNADNA分子時，應去除分子時，應去除RNARNA，反之亦然。，反之亦然。 降低溫度，改變降低溫度，改變pHpH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當然，的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有

5、利，當然，幾個條件并用更好。幾個條件并用更好。 對于對于DNADNA，抑制，抑制DNaseDNase活力很容易，但防止機械張力活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。拉斷則更重要。 對于對于RNARNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制制RNaseRNase活力較難，故在活力較難，故在RNARNA提取中設法抑制提取中設法抑制RNaseRNase更更重要。重要。核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑 lDNase抑制抑制 加入少量金屬離子螯合劑，如加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，或檸檬

6、酸鈉，DNaseDNase基本可以全部失活。基本可以全部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及去垢劑、蛋白變性劑及DNaseDNase抑制劑也可使抑制劑也可使DNaseDNase失活。失活。lRNase抑制抑制 操作要帶手套。操作要帶手套。 所有器皿要嚴格消毒，所有器皿要嚴格消毒， 試劑處理試劑處理 低溫操作低溫操作 在分離過程中要加入一定的在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。抑制劑。 常用的常用的RNA酶抑制劑酶抑制劑 焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC） 抑制強烈、不徹底抑制強烈、不徹底 異硫氰酸胍異硫氰酸胍 有效抑制、分解核蛋白有效抑制、分解核蛋白 氧釩核糖核苷復合物氧釩核糖核苷復合物 有

7、效抑制有效抑制 RNA酶的蛋白抑制劑（酶的蛋白抑制劑（RNasin） 有效抑制有效抑制 其它：其它：SDS、尿素、硅藻土等、尿素、硅藻土等 有效抑制有效抑制l核酸制備中常用的去垢劑核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負電荷，結合帶正電荷的蛋白質。用于核酸核酸本身帶負電荷，結合帶正電荷的蛋白質。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。 去垢劑的作用：去垢劑的作用： 1 1溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂； 2 2溶解核糖體上面的蛋白質，使其解聚，將核酸釋放出溶解核糖體上面的蛋白質，使其解聚，將核酸釋放出來；來； 3 3對對RNa

8、se、DNase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。如：如：SDS、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、4-4-氨基水楊酸鈉、萘氨基水楊酸鈉、萘-1.5-1.5-二磺酸鈉、二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉三異丙基萘磺酸鈉 作用：作用： 1. 1.使蛋白質變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造使蛋白質變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。 2. 2.使蛋白質變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。使蛋白質變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 3. 3.某些蛋白質變性劑也有抑制某些蛋白質變性劑也有抑制 RNase活性和破裂細胞的作活性和破裂細胞的作用。用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、如：苯酚、

9、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備中常用的蛋白質變性劑核酸制備中常用的蛋白質變性劑l核酸制備中常用的酶核酸制備中常用的酶 DNase: :降解降解DNADNA RNase：降解：降解RNARNA 蛋白酶蛋白酶K K：降解蛋白質：降解蛋白質 溶菌酶溶菌酶：破碎細胞：破碎細胞 3. 核酸制備的一般步驟：核酸制備的一般步驟：I. I.材料準備材料準備II.II.破碎細胞或包膜內容物釋放破碎細胞或包膜內容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質沉淀或吸附核酸，并去除雜質V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中1 1）破碎細胞）破碎細胞（防

10、止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用） 微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。 高等植物高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。：搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復凍融或液氮凍后組織搗碎。冰凍法：反復凍融或液氮凍后組織搗碎。 動物動物：液氮處理后用勻漿器或者研缽破碎。：液氮處理后用勻漿器或者研缽破碎。 細胞器細胞器DNADNA：首先純化細胞器。：首先純化細胞器。以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑2 2）破碎抽提核酸除去雜質）破碎抽提核酸除去雜質首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它首先使

11、脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離成分分離使核酸與蛋白質分離使核酸與蛋白質分離除去脂類除去脂類 多糖的除去多糖的除去 3 3）核酸的純化）核酸的純化 根據所需核酸的性質和特點除去其它核酸污染根據所需核酸的性質和特點除去其它核酸污染, ,并除去提取過程中的系列試劑并除去提取過程中的系列試劑( (鹽、有機溶劑等）鹽、有機溶劑等）雜質，最后得到均一的核酸樣品。雜質，最后得到均一的核酸樣品。 4 4）核酸樣品的保存）核酸樣品的保存 核酸保存的主要條件是核酸保存的主要條件是溫度溫度和和介質介質 溫度溫度： 4 4 樣品經常使用樣品經常使用 -70 -70是長期保存的良好溫度，為一次性保存

12、是長期保存的良好溫度，為一次性保存 -20 -20保存保存, ,避免反復凍融避免反復凍融 保存介質保存介質： 滅菌水滅菌水 TETE緩沖溶液緩沖溶液( (最常用最常用) )： 10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0三、動物基因組三、動物基因組DNA的提取的提取主要方法：主要方法：(1)濃鹽法濃鹽法利用利用RNP和和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。1）用）用1M氯化鈉提取氯化鈉提取,得到的得到的DNP粘液粘液2)與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化使乳化3)離心除去蛋白質離心除去蛋白質,此

13、時蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相此時蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相中間，而中間，而DNA位于上層水相中位于上層水相中4)用用2倍體積倍體積95%乙醇可將乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來鈉鹽沉淀出來.三、動物基因組三、動物基因組DNA的提取的提取（2）陰離子去污劑法）陰離子去污劑法:用用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質變性或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質變性,可以直接從生物材料中可以直接從生物材料中提取提取DNA。由于細胞中由于細胞中DNA與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合,而陰離子而陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑提取所以常用陰

14、離子去污劑提取DNA。三、動物基因組三、動物基因組DNA的提取的提取（3）苯酚抽提法）苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了同時抑制了DNase的降解作用。的降解作用。用苯酚處理勻漿液時用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與由于蛋白與DNA連接鍵已斷連接鍵已斷,蛋白分子表面又蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復操作，再合并含重復操作，再合并含DNA的水相。的水相。利用核酸不溶于醇的性質，用乙醇沉淀利用核酸不溶于醇的性質，用

15、乙醇沉淀DNA。此法的特點是使提取。此法的特點是使提取的的DNA保持天然狀態保持天然狀態。DNA的提取：的提取：苯酚抽提法（試劑盒）苯酚抽提法（試劑盒）1. 材料、設備及試劑材料、設備及試劑材料：材料：冷凍或新鮮豬肝組織冷凍或新鮮豬肝組織設備：設備：EP管、微量取液器管、微量取液器(20l,200l,1000l)，臺式高速臺式高速離心機，離心機，渦旋振蕩器渦旋振蕩器試劑：試劑：RNase ARNase A、Proteinase KProteinase K、Lysis Buffer Lysis Buffer 、Wash buffer Wash buffer A A、 Wash buffer B

16、Wash buffer B、TE bufferTE buffer。實驗前：實驗前：Wash buffer AWash buffer A中加入中加入18ml 18ml 無水乙醇，充分混勻；無水乙醇，充分混勻； Wash buffer B Wash buffer B中加入中加入64ml 64ml 無水乙醇，充分混勻無水乙醇，充分混勻1）樣品預處理樣品預處理取新鮮動物組織取新鮮動物組織25-50mg（組織量不宜過多，否則容易（組織量不宜過多，否則容易導致裂解不完全而堵塞離心柱），組織剪碎或者切成小導致裂解不完全而堵塞離心柱），組織剪碎或者切成小塊，直接放入勻漿器中勻漿。塊，直接放入勻漿器中勻漿。2）

17、加入加入600l的的LysisBuffer，顛倒充分混勻。如需消，顛倒充分混勻。如需消化化RNA，可加入，可加入20lRNaseA，顛倒混勻，室溫放置，顛倒混勻，室溫放置5min。3）加入加入10lProteinaseK，混勻。，混勻。56水浴水浴45min-1h，其間顛倒混勻數次直到看到組織完全裂解，裂解完全的其間顛倒混勻數次直到看到組織完全裂解，裂解完全的標準為液體變得清亮及粘稠。（此步驟可以過夜處理）標準為液體變得清亮及粘稠。（此步驟可以過夜處理）2. 操作步驟操作步驟n4）12,000 rpm 12,000 rpm 離心離心10 min10 min，將上清轉入新的離心管，將上清轉入新的

18、離心管中，加入中，加入800 l 800 l 無水乙醇，混勻。無水乙醇，混勻。n5）將液體轉入離心柱（一次加不完，可分次轉入），將液體轉入離心柱（一次加不完，可分次轉入），12,000 rpm 12,000 rpm 離心離心1min1min，棄廢液。，棄廢液。n6） 加入加入700 l Wash buffer A700 l Wash buffer A（使用前請先檢查是（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），否已加入無水乙醇），12,000 rpm 12,000 rpm 離心離心30 s -1 min30 s -1 min，棄廢液。棄廢液。n 7）加入加入700 l Wash buffer B（使

19、用前請先檢查是（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），否已加入無水乙醇）， 12,000 rpm 離心離心30 s -1 min，棄廢液。，棄廢液。8）加入加入500lWashbufferB，12,000rpm離心離心30s-1min，棄廢液。棄廢液。9）再次再次12,000rpm離心離心2min，將離心柱置于新的離心管，將離心柱置于新的離心管中，并打開離心柱蓋，于室溫或中，并打開離心柱蓋，于室溫或37恒溫箱放置恒溫箱放置510min，直至無明顯乙醇味。直至無明顯乙醇味。10）在硅基質膜中央加入在硅基質膜中央加入50-200lTEbuffer(事先預熱事先預熱55-65)，置于室溫，置于室溫2-

20、5min，12,000rpm離心離心30s。11）離心得到的溶液再次加入離心柱中，室溫放置離心得到的溶液再次加入離心柱中，室溫放置2min，12,000rpm離心離心2min。所得的溶液為純化后的基因組。所得的溶液為純化后的基因組DNA。稱取肝臟稱取肝臟0.5g冰冷的生理鹽水清洗（冰冷的生理鹽水清洗（3次）次）剪碎剪碎5 5mlml生理鹽水生理鹽水勻漿勻漿各組取各組取1/1/1010組組織細胞液織細胞液移至移至1.5ml離心管離心管加加600ulLysis BufferLysis Buffer加加20ulRNase ARNase A顛倒混勻，顛倒混勻，放置放置5min加加10ulProtein

21、ase KProteinase K混勻混勻5656水浴，水浴，45min45min顛倒混勻數次顛倒混勻數次至液體變清亮至液體變清亮及粘稠及粘稠12000rpm12000rpm，10min10min離心離心取上清轉入新離心管取上清轉入新離心管加加800ul無水乙醇無水乙醇混勻混勻轉入離心柱轉入離心柱可分次轉入可分次轉入12000rpm12000rpm，1min1min離心離心棄廢液，加入棄廢液，加入700ul Wash buffer AWash buffer A12000rpm12000rpm，1min1min離心離心棄廢液，加入棄廢液，加入700ul Wash buffer BWash buf

22、fer B12000rpm12000rpm，1min1min離心離心棄廢液，加入棄廢液，加入500ul Wash buffer BWash buffer B12000rpm12000rpm，1min1min離心離心棄廢液棄廢液12000rpm12000rpm，2min2min離心離心將離心柱置新離心管中，將離心柱置新離心管中，開離心柱蓋，放置開離心柱蓋，放置5min柱膜中央加柱膜中央加100ul65預熱的預熱的TE buffer放置放置3min12000rpm12000rpm，30sec30sec離心離心取離心后所得溶液再加入取離心后所得溶液再加入離心柱中，放置離心柱中，放置2min12000

23、rpm12000rpm，2min2min離心離心收集離心后所得溶液，即為純化后基因組收集離心后所得溶液，即為純化后基因組DNA 最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融反復凍融 提取血液基因組提取血液基因組DNADNA時，要選擇有核細胞時，要選擇有核細胞（白細胞）（白細胞） 細胞培養時間不能過長，否則會造成細胞培養時間不能過長，否則會造成DNADNA降降解解 含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量較少，提取前先含量較少，提取前先富集富集 材料應適量，過多會影響裂解，導致材料應適量，過多會影響裂解，導致DNADNA量量少，純度低少，純度低 針對不同材料，選擇適當的裂解預處理方式：針對不同材料，選擇適當的裂解預處理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細胞蛋白酶組培細胞蛋白酶K K細菌溶菌酶破壁細菌溶菌酶破壁 高溫溫浴時，定時輕柔振蕩高溫溫浴時，定時輕柔振蕩 采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DN