1、MIJ 大鼠 Klhl10 、Insl3 、Acr 、Zmynd15基因的克隆與序列分析目的 : 有接近 15%新組成的家庭會承受不孕癥的困擾, 大部分是由于分子和遺傳因素導致的不孕。雖然有許多基因涉及不育, 但是目前只有一小部分基因被確定。遺傳因素導致男性不育受到越來越多的關注。盡管做了許多努力 , 但是臨床上只有少數相關基因多態性被確定。這主要是由于男性不育癥的多因素的性質, 研究設計難度大以及沒有好的實驗模型的原因,因此迫切需要建立能用于男性不育研究的動物模型。MIJ 大鼠的雄性后代中穩定出現不育個體 , 經遺傳測交實驗證實為常染色體上的單一隱性基因突變所致。MIJ 近交系大鼠有望成為生

2、殖領域研究的良好動物模型。因此突變基因的定位將極大地幫助MIJ 大鼠的保種、繁殖及其推廣應用。 通過前期的表達譜基因芯片篩選 , 篩選到 10 個和雄性不育相關的差異表達基因, 然而并不清楚是否是由于表達差異基因的突變導致了MIJ 大鼠的不育。為了進一步研究 MIJ 雄性不育大鼠的基因突變情況, 本實驗對 MIJ 雄性不育大鼠 ,MIJ 雄性正常大鼠和 MIJN雄性大鼠 Klhl10(kelch-likefamilymember10) 、Insl3(insulin-like 3)、Acr(acrosin)和 Zmynd15(zinc finger,MYND-typecontaining 15)

3、四個基因進行了克隆測序和序列比對研究。方法: 根據搜索RGD(Rat Genome Database)得到大鼠的 DNA基因序列 , 用 Primer 5.0軟件對Klhl10 、 Insl3 、Acr 、Zmynd15四個基因的序列進行引物設計, 并送公司進行合成 , 對 MIJ 雄性不育大鼠、 MIJ 雄性正常大鼠和 MIJN 雄性大鼠基因組 DNA分別進行 PCR擴增 , 將擴增出來的特異性片段連接 T克隆載體 , 對連接成功的質粒進行酶切鑒定 , 將酶切鑒定克隆成功的陽性質粒送公司測序 , 將三種大鼠的基因片段測序結果進行比對 , 對各個片段進行拼接分析, 以期得到 MIJ 雄性不育大

4、鼠相對于MIJ 雄性正常大鼠、 MIJN 雄性大鼠的突變所在。結果:1 完成了對 MIJ 雄性不育大鼠 ,MIJ 雄性正常大鼠和MIJN雄性大鼠的 Klhl10 、Insl3 、Acr 、Zmynd15四個基因的克隆將 PCR產物連接 T載體 , 篩選酶切鑒定連接成功克隆的質粒, 完成了對MIJ 雄性不育大鼠 ,MIJ 雄性可育大鼠和MIJN大鼠的 Klhl10 、Insl3 、Acr 、Zmynd15四個基因克隆。Klhl10 、Insl3 、Acr 和 Zmynd15基因分別制備 36,2,8,8個克隆 ,3 種大鼠共制備 54 個克隆。 2 完成了對 MIJ 雄性不育大鼠 ,MIJ 雄性

5、可育大鼠和 MIJN 大鼠Klhl10 、 Insl3 、Acr 、Zmynd15四個基因的 54 個克隆片段的測序將克隆成功的MIJ 雄性不育大鼠 ,MIJ 雄性可育大鼠和MIJN大鼠的 Klhl10 、Insl3 、Acr 、Zmynd15四個基因的 54 個克隆片段進行了克隆測序。3 對 MIJ 雄性不育大鼠 ,MIJ 雄性正常大鼠和 MIJN 雄性大鼠的 Klhl10 、Insl3 、 Acr、 Zmynd15四個基因的測序結果進行拼接及比對分析Klhl10 基因的堿基有 16367pb, 共制備 36 個克隆 , 重疊堿基為 3251bp;Insl3 基因的堿基有 1940pb, 共

6、制備 2 個克隆 , 重疊堿基為 75bp;Acr基因的堿基有 6187pb, 共制備 8 個克隆 , 重疊堿基為 646pb;Zmynd15基因的堿基有 6614pb, 共制備 8 個克隆 , 重疊堿基為 623pb, 通過 DNAstar 軟件進行拼接 , 并去除多余部分堿基。將 MIJ 雄性不育大鼠 ,MIJ 雄性可育大鼠和 MIJN大鼠 Klhl10 、Insl3 、Acr 、Zmynd15四個基因的序列拼接結果用DNAMEN軟件進行序列比對 , 未發現突變堿基。結論 :1 首次報道了 MIJ 雄性不育大鼠 ,MIJ 雄性正常大鼠和 MIJN雄性大鼠 Klhl10 、Insl3 、Acr 、Zmynd15四個基因的 DNA序列。 2 排除了 MIJ 雄性不育大鼠的突變基因位于 Klh