1、異位寧對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥表皮生長因子受體的影響(一)【摘要】目的：探討異位寧對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥表皮生長因 子受體表達(dá)水平的影響。方法：以免疫組化法定性檢測各組子宮內(nèi)膜 異位大鼠的表皮生長因子受體(EGFR的表達(dá)水平。結(jié)果：模型對(duì)照組 EGFR勺陽性表達(dá)率偏高，與正常對(duì)照組比擬有顯著差異，異位寧高劑 量組中EGFR的陽性表達(dá)率明顯偏低，與模型對(duì)照組相比有顯著差異 (P0.01)。結(jié)論：異位寧可以抑制異位內(nèi)膜血管的形成，從而抑制異位 子宮內(nèi)膜增生,為研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制開拓了新途徑。【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥異位寧表皮生長因子受體大鼠子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis

2、,EM)是指具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織 出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位。由于現(xiàn)代診療技術(shù)的不 斷提高，EM的診斷率不斷上升。而在內(nèi)異癥中，異位內(nèi)膜病灶的生長 需要新的血管供給，EGF是血管生長因子家族中的一員，可以刺激血管 內(nèi)皮細(xì)胞生長和體內(nèi)新生血管形成。而 EGF受體 (epidermalgrowthfactorreceptor, EGFF是表皮生長因子(EGF及轉(zhuǎn)化生長 因子的共同受體1 5。本研究采用免疫組化法定性檢測各組子宮內(nèi) 膜異位大鼠的表皮生長因子受體(EGFR的表達(dá)水平，探討異位寧對(duì)EGFF表達(dá)的影響。1材料與方法1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用 Wistar雌性未孕大鼠，體重(2

3、00+20)g,鼠齡812 周，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，微生物控制等級(jí)為壹級(jí)。1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物異位寧 :由赤芍、柴胡、蓬莪術(shù)、延胡索、蜈蚣、黃芩、 金銀花、薏苡仁、秦艽、牡蠣等中藥組成，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附 屬醫(yī)院，上藥共計(jì)200g,加水700mL,浸泡30min,頭煎武火40min, 取汁200mL,二煎文火30min，取汁200min,二煎共得藥液400mL,文 火濃縮至100mL，加95%乙醇200mL，置冰箱靜止24h離心(1600轉(zhuǎn)/ min)，取上清液250mL,置水浴鍋提取乙醇，取藥液40min，相當(dāng)于每 毫升含生藥5g，置于4C冰箱內(nèi)備用。達(dá)那唑：100mg/粒

4、，上海華聯(lián) 制藥生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20040902。EGFF免疫組化染色試劑盒 免疫組化常用輔助試劑：武漢博士德生物工程。1.2 方法造模方法雌性未孕 Wistar大鼠，體重(200 士 20)g皮下注射乙烯雌 酚0.2mg/只促情，以20%烏拉坦1.5g/kg注射麻醉，待麻醉生效后， 將大鼠固定操作臺(tái)上,腹部剪毛,碘伏消毒,在無菌條件下開腹,約 1.5cm 長,右側(cè)離卵巢 0.5cm 處別離子宮,結(jié)扎后在中間剪取約 2cm 一段子宮,剖開子宮剝離子宮內(nèi)膜,將內(nèi)膜剪成 3 塊,分別縫于子宮 分叉處、左側(cè)卵巢附近、左側(cè)腹膜壁層,關(guān)腹縫合。每鼠注射慶大霉 素0.1mL,連用3d,正常清潔飼養(yǎng)。分組觀

5、察正常飼養(yǎng) 1 個(gè)月后,隨機(jī)抽取 10只造模大鼠 2次開腹。 可見移植宮內(nèi)膜體積增大,局部增大物內(nèi)含液體物質(zhì),局部增大物表 面被結(jié)締組織包裹, 大網(wǎng)、腸管、腹壁廣泛粘連。 此后開始灌胃給藥。正常對(duì)照組：每日灌服等容量蒸餾水。模型組：模型動(dòng)物術(shù)后1月開始，每日灌胃等容量的生理鹽水。異位寧高劑量組：模型動(dòng)物術(shù)后1月開始，每日以5.4g/100g異位寧藥液灌胃。異位寧低劑量組：模型動(dòng) 物術(shù)后1月開始，每日以1.8g/100g異位寧藥液給大鼠灌胃。西藥對(duì)照 組：模型動(dòng)物術(shù)后1月開始，每日以3.6mg/100g達(dá)那唑混懸液給大鼠 灌胃。均給藥4周后斷頭處死，剖取大鼠在位及異位子宮內(nèi)膜組織， 分為3局部分

6、別放入10%畐爾馬林中供做免疫組化的石蠟切片。實(shí)驗(yàn)方法EGFR用免疫組織化學(xué)方法檢測：1石蠟切片厚度5 am, 裱于Poly L lysine處理過的載玻片上，置45c溫箱拷片24h。切 片常規(guī)加水。33%H2O2室溫10min，滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡5min。4熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波 爐加熱，溫度保持在95C,持續(xù)10min。取出容器，室溫冷卻20min, PBS洗滌。5滴加復(fù)合消化液，室溫510min, PBS洗滌2min/次， 共3次。6滴加正常山羊血清封閉，室溫孵育 10min。7傾去血清， 滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，置于濕盒內(nèi)37C溫箱孵育60min ,PBS洗滌， 5min/次，共3次。8滴加生物素二抗，37C溫箱孵育20min, PBS 洗滌，5min/次，共3次。9滴加鏈霉親和素過氧化物酶，置于濕盒內(nèi)37 C溫箱孵育20min, PBS洗