1、高效液相色譜法測(cè)定血漿中雷公藤甲素和雷公藤酮王朝虹 1, 張吉林 2, 何 毅 1, 侯小平 1(1. 公安部物證鑒定中心, 北京 100038; 2. 黑龍江省公安廳, 哈爾濱 150008作者簡(jiǎn)介 王朝虹 (1974- , 女 , 北京人 , 助理研究員 , 博 士 , 主要從事毒物分析工作。摘要 目的 建立高效液相色 譜法定 量檢測(cè)人 血漿中 雷公藤 甲素和 雷公藤 酮的分 析方法。 方法 以 OasisHLB 固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行提取, 應(yīng)用 HPLC 色譜法二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定。 結(jié)果 該方法的回收率 高于 80%, 線 性范圍在 101000ng/ml, 經(jīng)該方法 測(cè)得雷公藤甲素的

2、最小 檢出限為 3 0ng/ml, 雷公 藤酮的 最小檢出 限為 4 5ng/ml (S/N 3 。結(jié)論 該方法快 速靈敏、準(zhǔn)確 , 適 用于雷公藤中毒的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。 關(guān)鍵詞 法醫(yī)毒物分析 ; 雷公藤甲素 ; 雷公藤酮 ; 高效液相 ; 固相萃取文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1001-5728(2004 05-0268-03Determination of Triptolide and Triptonide in plasma by HPLC ( Wang Zhao hong, Zhang ji lin, He Yi, et al. /Forensic Science Institute o f P

3、ublic Security Ministry , Bei j ing 100038, ChinaAbstract Objective To establish a method for quantitative determination of triptolide and triptonide in human plasma sa mples by HPLC. Methods The samples were extracted with Oasis HLB solid phase extraction cartridge and analyzed with reserved phase

4、HPLC coupled with diode array detection. Results Recoveries rates obtained from spiked plasma for the two diterpenoid were higher than 80%.The linearity ranged from 10ng/mlto 1000ng/ml.Detection limits of the method were 3 0ng/ml for triptolide and 4 5ng/mlfortriptonide. C on clusion The method is f

5、ast and accurate, which is applicable to determination of diterpenoid in cases of suspected poisoning of Triptergium wilfordii Hook f in forensic practice.Key words Forensic toxicological analysis; Triptolide; Triptonide; HPLC; SPE 雷公藤 (Triptergium wilfordii Hook f 為衛(wèi)矛科 植物雷公藤的 根。分布于長(zhǎng)江流域以南及西南 , 主 產(chǎn)于長(zhǎng)

6、江中、下游地區(qū) 1 。同屬植物 尚有昆明山海 棠 (T Hypoglaucum (Levl Hukeda 、東 北 雷 公藤 (T Regelli Sprague et Takeda等 2。在傳統(tǒng)中醫(yī)中雷 公藤具有活血化瘀、清熱 解毒、消腫散 結(jié)、殺蟲(chóng)止 血等功效。目前從雷公藤屬植物中分離得 70 余種成 分 , 主要是生 物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類 及多糖。雷公藤 的主要活性成分為二萜類及生物堿 類 , 具有毒性 , 以二萜類 化合物毒性最 強(qiáng) , 主要對(duì) 心、肝、胃腸道 及骨髓等 器官損傷 嚴(yán)重3。有資料統(tǒng)計(jì)雷公藤的毒副作用在 傳統(tǒng)藥物中居第三位 , 僅 次于洋金花和烏頭 4, 據(jù)不

7、完全統(tǒng)計(jì) , 19811997年 間發(fā)生雷公藤中毒 317 例 , 其中死亡 90 例 5 。目前 , 對(duì)于 雷公藤屬植物中二萜 化合物的分析 多集中于主要有效成分雷 公藤甲素在生藥、粗提物 以及各種制劑中的含量測(cè) 定 , 分析方法有薄層掃描 法 6 、氣相色譜法 7、高效液相色譜法 8-10, 關(guān)于其他二萜化合物測(cè)定方法報(bào)道很少11, 12, 人體液及組織中該類二萜化 合物的測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒 于以 上情況 , 本實(shí)驗(yàn)以環(huán)氧二萜類中兩個(gè)主要毒性 及活 性成分 雷公 藤甲 素 (Triptolide 和雷 公 藤酮 (Trip tonide 為目標(biāo)化合物 , 以人血漿為分析基質(zhì) , 應(yīng)用 固相

8、萃取法提取、高效液相 -二極管陣列檢測(cè)的方 法 , 建立了 快速、靈 敏、準(zhǔn)確 的分析方 法 , 能有 效 的測(cè)定血漿中雷公藤甲素和雷公藤酮含量。1 材料與方法111儀器高效液相色譜系統(tǒng) Waters 600E HPLC 色譜儀 , 配 有在線脫氣機(jī) , 717 加強(qiáng)型自動(dòng) 進(jìn)樣器 , 996PDA 檢 測(cè)器 , Millennium 32 色譜工作站。 1 1 2 試藥雷公藤甲素及雷公藤酮 購(gòu)于福建醫(yī)藥工業(yè)研 究 院 , 安定購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所。甲醇、乙腈、濃磷酸為色譜純?cè)噭?(Fisher Sci entific, Pittsburgh, PA, USA , 去離子水由蒸餾水經(jīng) M

9、illipore Simplicity 純水系統(tǒng)制備。 OasisHLB 固 相萃 取柱購(gòu)于 Waters 公司 (Milford, MA, USA。 1 1 3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精密稱取雷公藤甲素及雷公藤酮5mg 于 5ml 容量中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志2004 年第 19 卷第 5 期瓶中 , 加少量甲 醇溶解并加甲醇稀釋至刻度得濃度 為 1 0mg/ml 濃標(biāo)液。精密稱取安定 10mg 于 100ml 容 量瓶中 , 加甲醇溶解并稀釋至刻度得濃度為 0 1mg/ml 濃內(nèi)標(biāo)液。濃標(biāo)液儲(chǔ)存于 0 冰箱中 , 工作液在 使用前由濃標(biāo)液逐級(jí)稀釋制得。 1 14 儀器分析條件分析柱 :Sym metry Sh

10、ield TM RP 18 柱 4 6mm I D 250mm, 5 m, 保護(hù)柱 3 9mm I D 20mm, 5 m; 流 動(dòng)相 :乙腈 水 (40 60 ; 流速 1ml/min; 柱溫 40 ; 檢測(cè)波長(zhǎng) 217nm 。1 2 實(shí)驗(yàn)方法精密吸 取 100 l 內(nèi) 標(biāo)液 (1 g/ml 于 玻璃 試管中 , 40 氮?dú)饬鞔蹈伞Ｏ群笥诖瞬Ａг嚬苤屑尤?ml血漿 , 20 l 濃磷酸 , 4ml 去離子水 , 渦旋混合 2min, 于 8000r/min 離心 10min, 上清液上樣 Oasis HLB 固 相萃取柱 , 先后以 1ml 2%氨水 20%甲醇溶液和 1ml 2%醋酸30%

11、甲醇溶液洗去雜質(zhì) , 最后以 1ml 80%甲 醇溶液 洗脫待測(cè)樣品 , 洗脫液氮?dú)?流吹干 , 溶解 于 100 l 流動(dòng)相中 , 取 20 l 進(jìn)樣。2 結(jié) 果空白血漿和添加雷公藤甲素和雷公藤酮血漿的 HPLC 色譜圖見(jiàn)圖 1。由圖 1A和 B 比較可見(jiàn)此提取分離方法能有效消除血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。圖 1 HPLC 色譜圖 A. 空白血漿 ; B. 添加 標(biāo)樣血漿F ig 1 HPLC Chromatograms of the sample containing triptolide and triptonide A. Blank plasma; B. spiked plasma2 1 校

12、正曲線與最小檢測(cè)限于空白血漿中添加不 同濃度的標(biāo)樣 工作液 , 使 雷公藤甲素和雷公藤酮濃度在 101000ng/mL, 按上 述 1 2 項(xiàng)步驟對(duì)樣品進(jìn)行提取、分離 , 以測(cè)得雷公藤 甲素和雷公藤酮峰面積 /內(nèi)標(biāo)峰面積 (y 對(duì)添加濃度 (x 作校正曲線 , 雷公藤甲素的相關(guān)系數(shù) r2=0 9997, 雷公藤酮的相關(guān)系數(shù)r 2=0 9991。以信噪比 3 1 計(jì) 算 , 該方法測(cè)得雷公藤甲素的最小檢測(cè)限3 0ng/ml, 雷公藤酮的最小檢測(cè)限4 5ng/ml 。 2 2 精密度試驗(yàn)日內(nèi)精密度和日間精密度由 2 個(gè)添加濃度 (20,500ng/ml 評(píng) 估 , 每一濃度添加樣品分別于同一日內(nèi)提

13、 取 分析 5 次 和于不同兩天提取分析 6 次 , 其變異系數(shù)見(jiàn) 表1。由表 1 可 見(jiàn)該方法的重現(xiàn)性和重 復(fù)性均較好。表 1 血漿中雷公藤甲素及雷公藤酮的精密度實(shí)驗(yàn)Table 1 RSD of triptolide andtriptonide in Plasm a Samples日內(nèi)精密度 IntradayR SD(%日間精密度 InterdayR SD(%雷公藤甲素 4 872 3814547 24 雷公藤酮6 073 3311 007 552 3 回收率試驗(yàn)回收率實(shí)驗(yàn)選用 20, 100, 500ng/ml 血漿 3 個(gè)添 加濃度 , 每一濃度平行操作 5 次 , 回收率由添加樣品 中

14、二萜化合物峰面積 /相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中二萜化 合物峰面積求得 , 結(jié)果見(jiàn)表 2。表 2 血漿中雷公藤甲素及雷公藤酮的回收率 ( s Table 2 Extraction recoveries oftriptolide and triptonide in plasma samples20ng/ml100ng/ml 500ng/ml 雷公藤甲素 84 38 13 1896 32 1 9199 66 8 94雷公藤酮103 205 6492 0734387757102 4 臨床應(yīng)用應(yīng)用該分析方法測(cè)定一 長(zhǎng)期服用雷公藤多甙 片 治療紅斑狼瘡患者 (女 , 20 歲血漿樣品 , 從 該患 者血 漿 中

15、 檢 出 雷 公 藤 甲 素 57 99ng/ml, 雷 公 藤 酮 10 28ng/ml 。3 討 論本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)血樣中雷公藤甲素和雷公藤酮的中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志2004 年第 19 卷第 5 期提取方法進(jìn)行了考查, 經(jīng)比較采用乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取內(nèi)源性雜質(zhì)干擾嚴(yán)重 , 而由二乙烯苯和乙 烯吡咯烷酮聚合而成 Oasis HLB 固相萃取柱可在 pH1 14 范圍內(nèi)使用 , 因此可應(yīng)用氨水溶液和醋酸溶液 除去血漿中的大部分干擾 組分 , 獲得更為干凈的樣 品 , 且回收率也較好。因此 , 本實(shí)驗(yàn)選用 Oasis HLB 固相萃取柱對(duì)血漿樣品進(jìn)行提取。有文獻(xiàn)報(bào)道以衍生化氣相色譜 法測(cè)定雷公藤甲 素

16、7, 但雷公藤酮結(jié)構(gòu)中 無(wú)活潑氫 , 無(wú)法進(jìn)行衍生 化 , 因此不能用該方法同時(shí)測(cè)定這兩種 化合物。本 實(shí)驗(yàn)試圖應(yīng)用 LC/MS 法同時(shí)測(cè)定雷公藤甲素和雷公 藤酮 , 但由于這兩種化合物難以 電離 , LC/MS 法測(cè) 定靈敏度低于 HPLC/DAD 法 , 因此最 終選用反相高 效液相法 分析測(cè)定血漿 中雷公 藤甲素 和雷公 藤酮 , 該方法快速、靈敏、重現(xiàn) 性好 , 能有 效祛除復(fù)雜生 物基質(zhì)中內(nèi)源性雜質(zhì)干擾 , 適用于雷公藤中毒的法 醫(yī)毒理學(xué)檢驗(yàn)。參考文獻(xiàn)1 徐國(guó)鈞 .生藥學(xué) M.北京 :人民衛(wèi)生出版社,1994.263.2 曹敏,孫榮奇,吳達(dá)俊,等.中藥雷公藤的研究進(jìn)展J.中成藥 ,1

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