1、結課論文題 目突破衍射極限的超高分辨率成像的技術進展學生姓名學 號學 院專 業班 級二一五年十二月一 引言1.1 選題意義光學顯微成像具有極為悠久的歷史，但一直以來，光學成像一直受到衍射極限的限制而分辨率無法突破200 nm。后來雖然有了電子顯微鏡、核磁共振顯像、x光衍射儀等微觀觀測或者顯像設備，但是使用光學顯微鏡可以在活體狀態下觀察生命體使得其在生物、醫學觀察方面仍有巨大優勢。值得慶賀的是近年來，超高分辨率顯微技術的發展使得光學顯微成像分辨率達到了20 nm以下。其中德國科學家Stefan Hell、美國科學家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率顯微技術方面

2、的突出貢獻獲得了2014年的諾貝爾化學獎。在這篇文章中，我們就簡要介紹一下超高分辨率顯微技術的發展和應用，并對諸位大師致以敬意。1.2 技術指標顯微技術成像優劣一般通過X-Y平面分辨率與Z軸分辨率大小來判定，分辨率越高數值越小。下表是各種顯微成像技術的分辨率指標。成像技術X-Y平面分辨率（nm）Z軸分辨率(nm)普通光學顯微鏡200-300500-7004Pi顯微鏡100-150STED顯微技術50-70STED+4技術5050PALM技術20303D STORM技術20-3050-60dSTORM技術30502D SSIM技術503D SSIM技術100200電子顯微鏡0.05X光衍射儀0.

3、03-10二 衍射極限2.1 衍射極限我們能看到什么？看到多小的范圍？看得有多清楚？幾百年來，依靠不斷進步的科學手段，微觀世界正一層層揭開面紗，讓人們可以看得越來越“小”，進而可以進行研究。人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物體，再小，就要借助工具。1665年，英國科學家羅伯特·虎克制造了第一臺用于科學研究的光學顯微鏡，用它觀察薄薄的軟木塞切片。虎克看到了殘存的植物細胞壁，它們一個個像小房間一樣緊挨在一起，這就是“細胞”一詞的由來。 此后，顯微鏡制造和顯微觀察技術的迅速發展，幫助科學家第一次發現了細菌和微生物。那么，光學顯微鏡是否可以無止境地“放大”下去，讓我們想看到多小就能看到多小？科

4、學家為此做了很多嘗試，最終發現，存在一道法逾越的“墻”衍射極限。 1873年，德國科學家阿貝提出了衍射極限理論：光是一種電磁波，由于存在衍射，一個被觀測的點經過光學系統成像后，不可能得到理想的點，而是一個衍射像，每個物點就像一個彌散的斑，如果這兩個點靠得很近，彌散斑就疊加在一起，我們看到的就是一團模糊的圖像。 阿貝提出，分辨率的極限近似于入射光波長的二分之一(d=/2)。可見光的波長通常在380780納米之間，根據衍射極限公式，光學顯微鏡的分辨率極限就在200納米（0.2微米）左右。如果物體小于0.2微米，你仍舊看到的是一個模糊的光斑。這就是很長一段時間內，光學顯微鏡的分辨極限衍射極限。2.2

5、 突破衍射極限為了更深入的觀察世界，后來有了電子顯微鏡、核磁共振顯像、x光衍射儀等微觀觀測或者顯像設備，人們借助它們可以看得更“細”。但是這些設備依然沒有突破衍射極限，他們依然遵循著阿貝衍射極限。這些設備使用的是電子束等波長非常短的入射光，自然，它們的分辨率就高。比如電子顯微鏡，分辨率可以達到0.5埃（一埃等于十分之一納米），這樣就可以看到一粒一粒的原子。由于生物學、醫學方面的研究，更希望在生命體存活的自然狀態下進行觀察，在這方面，光學顯微鏡有它不可比擬的優勢。因此，光學顯微鏡的研發還是世界科學家的研究熱點。突破性的進展發生在本世紀初，近年來，隨著新的熒光探針和成像理論的出現，研究者開發了多種

6、實現超出普通共聚焦顯微鏡分辨率的三維超分辨率成像方法。較成熟的有基于單分子成像的超分辨率顯微成像方法，包括光激活定位顯微技術 (photoactivated localization microscopy, PALM) 和隨機光學重構顯微技術 (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。以及兩大類通過改造光源的點擴散函數來提高成像分辨率的方法，分別是受激發射損耗顯微技術(stimulated emission depletion, STED)和飽和結構照明顯微技術。(參考文獻：呂志堅，陸敬澤.幾種超分辨率熒光顯微技術的原理和近期進

7、展) 以上這些進展,都讓光學顯微鏡突破了衍射極限，我們稱之為“超分辨成像技術”。美國光學學會把它列為21世紀光學五大研究計劃之首。三 超高分辨率顯微技術3.1光激活定位顯微技術PALM當顯微鏡需要分辨兩個或者更多點光源的時候，很難突破光學分辨率的極限來進行精確定位而當顯微鏡的物鏡視野下僅有單個熒光分子的時候，通過特定的算法擬合，此熒光分子位置的精度可以很容易超過光學分辨率的極限，達到納米級如上所述，盡管單分子的定位精度可以達到納米級，但它并不能提高光學顯微鏡在分辨兩個或者多 個 點 光 源 時 的 分 辨 率2002 年 ， Patterson 和Lippincott-Schwartz首次利用

8、一種綠色熒光蛋白(GFP)的變種(PA-GFP)來觀察特定蛋白質在細胞內的運動軌跡這種熒光蛋白 PA-GFP 在未激活之前不發光，用 405 nm 的激光激活一段時間后才可以觀察到 488 nm 激光激發出來的綠色熒光德國科學家 Eric Betzig 敏銳地認識到，應用單分子熒光成像的定位精度，結合這種熒光蛋白的發光特性，可以來突破光學分辨率的極限2006 年 9 月， Betzig和 Lippincott-Schwartz 等首次在 Science 上提出了光激活定位顯微技術( photoactivated localization microscopy, PALM) 的 概 念 其 基

9、本 原 理 是 用PA-GFP 來標記蛋白質，通過調節 405 nm 激光器的能量，低能量照射細胞表面，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個熒光分子，然后用 488 nm 激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子在確定這些分子的位置后， 再長時間使用 488 nm激光照射來漂白這些已經定位正確的熒光分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來之后，分別用 405 nm 和 488 nm 激光來激活和漂白其他的熒光分子，進入下一次循環這個循環持續上百次后，我們將得到細胞內所有熒光分子的精確定位將這些分子的圖像合成到一張圖上， 最后得到了一種比傳統光學顯微鏡至少高 10 倍以上分辨率的顯微技術，如

10、圖 1 所示。PALM 顯微鏡的分辨率僅僅受限于單分子成像的定位精度，理論上來說可以達到 1 nm 的數量級。2007 年， Betzig 的研究小組更進一步將PALM 技術應用在記錄兩種蛋白質的相對位置，并于次年開發出可應用于活細胞上的PALM 成像技術來記錄細胞黏附蛋白的動力學過程。（參考文獻：Patterson G H, Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells；Betzig E, Patterson G H, Sougrat R, et

11、al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution；Shroff H, Galbraith C G, Galbraith J A, et al. Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes）圖1：應用PALM技術定位單個熒光分子最后實現超分辨率成像的示意圖A， B， C， D， E， F 展示了實際實驗過程及得到的原始數據； A，B， C， D

12、， E， F 展示了用高斯擬合確定熒光分子的中心，疊加產生了超分辨率圖像； (A, A) 未激活任何熒光分子時； (B, B) 用405 nm 的激光激活了 4 個熒光分子； (C, C) 用 488 nm 的激光觀察一段時間后漂白了第一輪激活的 4 個熒光分子； (D, D)第二輪重新激活的另外的幾個熒光分子； (E, E) 兩輪激活的熒光分子總和組成的圖像； (F, F) E 圖的局部放大3.2多色隨機光學重構顯微法PALM 的成像方法只能用來觀察外源表達的蛋白質，而對于分辨細胞內源蛋白質的定位無能為力。但是利用化學小分子Cy3和Cy5、 Cy7等熒光分子對的光轉換效應同樣可以達到突破光學

13、極限的效果。這項技術被稱為“隨機光學重建顯微術” (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。其發明人是哈佛大學的莊小威教授。這項技術是用很弱的光激發熒光分子，使細胞內的一小部分熒光分子發光，而不是全部。這樣由于發光的點分布比較分散，重疊比較少，因此每個光暈可以近似為一個熒光分子。在一次激發中，可以確定一部分光暈的中心，在下一次激發中，可以確定另外一部分光暈的中心，把這許多次激發的結果疊加，就是完整而清晰的圖像（圖2）。因此， STORM需要利用熒光發色團標記抗體對靶蛋白進行識別，可以檢測到內源性蛋白，避免由于外源性表達偶聯熒光蛋

14、白的靶蛋白對其定位產生的可能的影響，但是在活細胞應用中受到限制，并且也有可能受到免疫熒光染色過程的影響。隨后，他們又利用光學像散性實現了3D STORM，達到了平面2030 nm，縱向5060 nm的成像精度。（參考文獻：夏鵬，竇震.超高分辨率顯微技術研究進展；Huang B, Wang W, Bates M, et al. Three-dimensional superresolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy）利用某些熒光小分子自身可被反復激發淬滅的性質，通過與STORM相似的操作方法，可以實現單一熒

15、光分子的超高分辨率成像，這一方法大大簡化了原始STORM的樣品制備過程，被稱為dSTORM(direct STORM)。值得一提的是，莊小威研究組將SNAP標簽與靶蛋白融合表達，同時將熒光分子偶聯到可以結合SNAP標簽的小分子化合物上，進而標記靶蛋白，再通過降低溶解氧消耗系統以及脂肪族巰醇的添加量，成功地在三維超高分辨率的成像中實現了空間分辨率平面30 nm，軸向50 nm，時間分辨率12 s的優異效果。有意思的是幾種細胞膜標記物也被鑒定出具有光轉換性質，并被用于超高分辨率顯微成像，在活細胞中得到了3060 nm的空間分辨率和12 s的時間分辨率。最近，基于ImageJ的PALM/STORM數

16、據處理插件已經發布，為這兩種關鍵技術的應用提供了極大便利。（參考文獻：Heilemann M, van de Linde S, Schuttpelz M, et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes；楊光.隨機光學重建顯微中的光學設計與數據處理）但是， STORM 方法也存在缺陷，由于用抗體來標記內源蛋白并非一對一的關系，所以STORM 不能量化胞內蛋白質分子的數量，同時也不能用于活細胞測量。（參考文獻：毛錚樂，王琛.超分辨遠場生物熒光成像-突破光學衍射極限

17、）圖2：隨機光學重構顯微技術效果圖3.3 STED受激發射損耗顯微術在1994年， Stefan提出了一種理論，利用受激輻射損耗原理，將一束由相位調制產生的空心環形激光圍繞激發光，導致環形區域內的分子受激輻射，而只有光束中心部分的熒光分子被激發光照射產生自發輻射，進而被獨立檢測出來。隨著環形激光強度不斷升高，其孔徑也相繼減小，藉此突破光學極限(圖3)。他們將這種顯微鏡技術命名為STED(stimulated emission depletion microscopy)。幾年后他在哥廷根大學制造出了這種顯微鏡，將xy軸分辨率水平從200 nm提升到了70 nm左右(圖3)，成功地打破了光學分辨率

18、極限。隨后， Hell領導的研究組又通過將STED與4Pi結合以及通過兩種相位調制的方法，將其從二維成像擴展到三維(3D STED)，實現了xyz三個方向上的超高分辨率成像。由于STED技術以共聚焦顯微鏡為基礎，因而在成像深度上具有很大的優勢，實驗證實其可以在350m厚度的腦切片中得到極高的分辨率。目前應用STED技術已經實現了在活體小鼠中直接對腦組織進行觀察，其觀察深度達1015m ，分辨率至少達到70 nm。（參考文獻：夏鵬，竇震.超高分辨率顯微技術研究進展）應用 STED 成像，點光源的光斑大小直接發生 改 變 ， 其 半 高 寬 大 小 從 傳 統 的 2nsin 變 成2nsin1+

19、IIsat，其中 I 是 STED 激光器的最大聚焦強度，而 Isat 則是當受激熒光強度被減少到 1/e時的 STED 激光的強度特征值由此公式可看出，當 I/Isat 的值趨近無窮大時， STED 成像的點光源的半高寬趨近于 0，亦即分辨率不再受光的衍射過程所限制STED 成像技術的最大優點是可以快速地觀察活細胞內實時變化的過程，因此在生命科學中應用更加廣泛例如，應用成熟的 STED 顯微成像技術發現，海馬神經元上囊泡蛋白 synatotagmin在各種刺激后都以一種“簇”的形式存在于神經突觸前端膜上，這首次揭示了這種膜蛋白以集合的形式存在于細胞質膜上然后被統一回收的方式。之后 Hell等

20、又進一步發展了這種方法，使之可以用于 EGFP標記的信號和多種顏色的超分辨率檢測目前， STED 作為一種成熟的方法，已經可以高速地監測活細胞內高分辨率圖像。例如在2008年Science上發表的文章表明，應用STED技術已經可以以視頻的速度(每秒 28 幀)來采集記錄神經細胞內突觸小泡的高分辨率圖像(50 nm)。（參考文獻：呂志堅，陸敬澤.幾種超分辨率熒光顯微技術的原理和近期進展；Willig K I, Kellner R R, Medda R, et al. Nanoscale resolution in GFP-based microscopy；Meyer L, Wildanger D

21、, Medda R, et al. Dual-color STED microscopy at 30-nm focal-plane resolution）STED技術的不足之處在于光學系統實現起來比較困難，需要非常強的STED激光來抑制受激點光源的激發。因此， Stefan進一步對這個系統進行了改進，他找到了一些具有可反復激發淬滅特性的熒光分子，利用其特性，將STED激光以高頻藍光代替，使得激發光束中心的點光源周邊的分子非常快速的被淬滅，待中心點光源成像后再移動光束進行下一個位置的激發-淬滅循環。這個改進中使用的高頻藍色激光所需要的能量較STED激光縮小了千倍，大大降低了對光學系統的要求。利用

22、這種原理， Stefan小組進一步發明了GSDIM(ground state depletion with individual moleculereturn)，可利用多種小分子進行超高分辨率顯微成像，可以得到5070 nm的分辨率。但是為使這些小分子可以反復激發和淬滅，需要在溶液中添加一種溶解氧消耗系統以及脂肪族巰醇，使得其無法應用于長時間的活細胞觀察。而后來發現的一些可反復激活型熒光蛋白，使得該方法在活細胞層次上的應用得到了進一步加強。圖2：STED超高分辨碼率成像技術3.4 飽和結構照明顯微技術SSIM改變光學的點擴散函數來突破光學極限的另一個 方 法 是 利 用 飽 和 結 構 照 明

23、 顯 微 技 術(saturated structure illumination microscopy, SSIM)早在 1963年， Lukosz 和 Marchand就提出了特定模式側向入射的光線可以用來增強顯微鏡分辨率的理論2005 年，加州大學舊金山分校的 Gustafsson 博士首先將非線性結構性光學照明部件引入到傳統的顯微鏡上，得到了分辨率達到 50 nm 的圖像。SSIM技術的原理是將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發射光模式中提取高分辨率的信息，如圖4所示。（參考文獻：呂志堅，陸敬澤.幾種超分辨率熒光顯微技術的原理和近期進展；候尚國.基于多種非線性效應的超分辨

24、成像研究)圖4：通過衍射的莫阿干涉效應來提高分辨率當一個未知結構的物體(a)被一個結構規則的照射模式(b)的光所照射時，會產生云紋條紋(moiré fringes)(c)云紋條紋發生在采樣物體的空間頻率與照射光線的空間頻率有差異的地方顯而易見，在顯微鏡下直接觀察，就可以看到它放大了原先不能夠分辨出來的樣本結構通過計算機進一步分析所有條紋中包含的信息，可以重組出樣本的高分辨率圖像。四 超高分辨率成像技術的發展趨勢4.1 z平面軸向的超高分辨率需求以上所討論的幾種超分辨率成像方法，其分辨率的改進都在 xy 平面而事實上，由于傳統顯微鏡在光傳播方向上(z 軸)的點擴散函數的半高寬大約為 2

25、nsin2 ，小于 xy 平面的半高寬 2nsin，因此其理論 z 軸分辨率本來就低于其 xy 平面的分辨率另外，對厚的生物樣本進行顯微三維成像時，由于樣本本身的折射系數與物鏡的折射系數不同，在 z 軸方向上產生顯著的球面象差(spherical aberration)，從而使圖像在 z 軸上的分辨率降低如果要充分觀察細胞內的三維精細圖像，就必須大幅度提高成像的 z 軸分辨率因此，近年來，國際上各個研究超分辨率顯微成像的小組也不斷地探索提升 z 軸分辨率的手段。（參考文獻：孫育杰，陳軒澤.淺談2014年諾貝爾化學獎：超高分辨率熒光顯微成像）4.2 超高分辨率顯微技術發展趨勢與 21 世紀初相比，三維超分辨率顯微成像已有很大的發展，有多種不同成像技術實際應用于生物系統的范例，甚至已經出現了商業化的超分辨率顯微成像系統但是，目前的成像模式仍然遠遠沒有達到完美狀態，對于固定樣本成像其三維分辨率還沒有達到可以和電子顯微鏡相媲美的幾個納米的范圍當前的發展趨勢是結合不同成像模式的優點，進一步提高成像的精度和準確