1、基因工程隨堂作業題 目：離子束介導轉基因技術簡介 院（系）：專業：班級：姓名：學號：成績：完成日期：離子束介導轉基因技術簡介在植物轉基因方法中,人們總是在全力尋找那些更為簡單、有效而又通用的手段,以便繞過復雜的原生質體培養過程,實現帶壁細胞的基因轉移。于是,便開始了應用物理方法進行植物轉基因的嘗試,并獲得了很大進展。其中較為成功的方法有電激法、基因槍或微彈轟擊法、注射法、激光穿孔法和超聲波法。這些方法就其本質來說,都是使細胞壁穿孔而又不傷害細胞,提供外源基因進入受體細胞的通道。20世紀80年代末,由于受到離子注入金屬、半導體等材料進行表面改性、摻雜等研究的啟示,中國科學院等離子體物理研究所余增

2、亮等人,率先嘗試將離子注入技術應用與生物材料,進行農作物品種的改良,并于1986年首次獲得成功。至此,一個新興的交叉學科離子束生物工程學問世,并日益受到國內外專家的關注。1991年余增亮等提出了離子束介導外源基因轉移的設想,隨后成功獲得了水稻轉基因植株。離子束介導轉基因技術打破了傳統的轉基因法( PEG法、電擊法、脂質體法等)操作繁瑣,轉化率低,重復性差,基因型依賴性強的限制,是一種較簡單易行的轉基因方法。1. 離子束介導轉基因技術的原理植物細胞表面存在細胞壁,是外源基因轉移的天然屏障。所有的轉基因方法都是通過打破這一屏障,或以易于外源基因導入的細胞或組織(如原生質體、萌發胚、子房和幼穗等)作

3、為受體而實現的。離子束介導轉基因的原理主要包括了3個方面,即通道作用、吸引作用和整合作用。首先,一定能量和劑量的離子束對植物細胞壁的濺射作用破壞細胞壁和細胞膜的結構,結果在局部產生刻蝕和穿孔,為外源遺傳物質進入細胞提供微通道,這就是離子束對生物體的通道作用。其次,用于注入的荷電正離子降低了細胞表面的負電性(沉積作用) ,從而減弱了對帶負電的外源DNA 的靜電斥力,從而促進了外源DAN的吸附和進入,即產生吸引作用。再者,離子束的直接和間接作用打斷細胞內的染色體DNA結構,有利于外源遺傳物質整合到受體基因組中,即整合作用。2離子束介導轉基因方法2. 1注入離子類型離子束介導轉基因技術目前所用的元素

4、離子種類主要有2種: N+和Ar+。安徽省開展離子束介導轉基因較早,多用Ar+作為注入離子。他們認為Ar+是一種惰性元素,不會與生物靶組織發生化學反應而沉積下來,最終以氬氣的形式逸出靶面。卞坡等進一步研究表明,在相同的能量和劑量下,Ar+的刻蝕效果優于N+。但是,吳麗芳等研究認為,用相同劑量、相同能量的N+和Ar+處理小麥成熟胚,結果兩種離子對小麥成熟胚出愈率的影響差異不顯著。河南省在進行外源大分子DNA轉移時,多用N+注入,其變異效果和三代的穩定情況并不比用Ar+ 的差。看來,拓寬離子束介導轉基因所用的注入元素離子的種類,仍是今后研究的重點。2. 2注入離子的能量和劑量注入離子的能量、劑量和

5、脈沖劑量直接關系到離子束介導轉化的效果。吳麗芳等研究認為,用離體小麥成熟胚為受體,以GUS基因(GFP基因)為供體,選用的離子注入能量在2025 keV時,介導轉基因效果較好。在能量為25 keV,脈沖劑量為2.6×1015 N+ /cm2 條件下,對小麥成熟胚進行處理,發現低劑量處理未導致出愈率降低,反而略有升高。然而,當劑量大于5 ×1016 ions/ cm2 時,會導致出愈率急劇下降。他們認為,選用4. 68 ×1016 ions/ cm2 作為離子束介導轉基因的注入劑量較為合適。吳麗芳等在以外源大分子裸露DNA為供體,成熟種子胚為受體(不是離體胚)時,所

6、用的照射能量為30 keV,劑量為7 ×1016 Ar+ /cm2。萇收偉等用俄羅斯制造的TITAN 全元素注入機,進行離子束輔助外源DNA轉移時,所用的照射能量為30 keV,束流200mA,脈寬400ms,頻率25 Hz,劑量為2 ×1017 N + / cm2。看來,不同的離子注入機在進行轉基因操作時,要摸索合適的參數條件。3.離子束介導轉基因程序3. 1受體前的處理挑選成熟種子,進行消毒。首先用70%的乙醇表面消毒1 min,用無菌雙蒸水沖洗干凈,接著用0. 1%升汞浸泡15 min (或用20%次氯酸鈉處理30 min) ,然后用無菌雙蒸水沖洗干凈, 用滅菌濾紙吸

7、干水液。3. 2離子束注入處理將滅菌后的種子,在無菌操作臺上用手術刀將胚切下,胚朝上均勻擺放在平皿中。將無菌微環境靶室用酒精滅菌,放入平皿,種胚朝離子束方向,打開直通閥,接收離子束的刻蝕,待處理完后立即將種胚侵入含供體DNA (50g/ml)的SSC導入介質中,溫育1 h左右,取出種胚用SSC溶液反復沖洗3次,無菌濾紙吸干殘存水液,接種到MS誘導愈傷培養基上。同時設2個對照,一個是種胚只放置在離子束注入的環境中,但不接受離子束注入處理,同樣浸入含DNA的SSC介質中;另一對照是種子胚接受和處理相同的離子束處理,不含DNA的SSC溶液溫育,兩個對照的其它操作均相同。3. 3抗愈傷組織的篩選及植株

8、再生處理和兩個對照在MS誘導愈傷培養基上預培養2天后,轉入含潮酶素40 mg/L的相同培養基上,培養20天后將產生的小愈傷連同母體轉入含潮酶素50mg/L的MS繼代培養基上繼續篩選,每2 周繼代一次,約40天后,將得到的穩定抗50 mg/L 潮酶素的愈傷組織塊,轉入分化培養上進行植株再生。3. 4再生植株的分子檢測目前所報道的離子束介導的轉基因植物,是用PCR和Southern來檢測證明受體基因組是否含有目的基因片斷。取再生植株的正常葉片,按盧揚江等介紹的方法提取并純化植物DNA,以用作PCR分析。反應結束后,取擴增產物進行瓊脂糖電泳。通過比較得到的擴增帶和預期的片段的大小來證明供體基因是否存

9、在于被測細胞中。取少量轉基因植株的DNA酶切消化,然后在瓊脂糖凝膠上進行電泳分離,按Southern的方法轉移到尼龍膜上,用缺口轉移法對酶切消化后分離得到的供體質粒DNA進行放射性同位素標記,并作為探針對轉移的基因組DNA進行雜交和放射自顯影分析。3. 5遺傳學分析將轉基因植株連同對照(種子萌發苗)栽插到田間。種子分別收獲脫粒后,取自交結實的轉基因植物種子進行表面消毒后,在含潮酶素的MSO ( 50 mg/L)培養基上發芽,對照組在50 mg/L的培養基上完全受到抑制,且很快死亡。而轉基因植株所獲得的潮酶素抗性性狀能夠通過種子進行后代遺傳。4. 離子束介導轉基因技術的突出優點第一,刻蝕和濺射作

10、用。荷能離子對生物材料具有極強的刻蝕和濺射作用,使細胞形成利于外源基因進入的可修復的微通道。第二,射程的可控性和集束性。利于精確控制被處理組織細胞的刻蝕程度、損傷范圍。第三,靜電作用。帶正電離子注入細胞后,電荷交換使微通道積累正電荷,便于吸收帶負電的外源DNA 主動進入細胞。第四,離子注入造成靶細胞DNA鏈的損傷,受體細胞對損傷的DNA 的修復,利于外源DNA 與受體DNA的重組與整合。第五,利用成熟種子的胚和愈傷組織作為外植體,便于取材和批量操作,同時也省去了原生質體制備和再生植株的麻煩,既方便又有效。5.離子束介導轉基因技術在農作物育種上的應用水稻:離子束介導轉基因這一技術首先在以水稻為受

11、體的研究中得到了證實。余增亮等首次用離子束介導的方法將報告基因GUS和CAT導入水稻成熟胚和懸浮細胞。楊劍波等將攜帶有報告基因hph(潮酶素抗性基因)的質粒pBI222和GUS(2葡萄苷酸酶基因)的pBI221分別導入水稻成熟胚和胚性懸浮細胞系中,獲得了轉基因水稻植株。在轉化的懸浮細胞中,組織化學染色法檢測到GUS的表達;而處理的成熟胚經潮霉素篩選得到3個穩定的抗性細胞系,并分化再生出32 株綠苗,其中移栽成活25 株,PCR擴增檢測均得到與預期大小相同的350bp的擴增片段,進一步的Southern blot證實, hph基因整合到受體基因組中并穩定遺傳。李紅將水稻幾丁質酶基因RCH8用此法

12、轉入多個水稻品種中,獲得一批經PCR和Southern blot檢測的轉基因植株,轉基因植株葉片的細胞粗提液表現出抑制被孢霉生長的作用。最近,安徽省農科院抗菌肽shiva基因導入水稻恢復系明恢63熟胚中,經愈傷誘導和綠苗再生, PCR檢測分析證明,外源基因已整合到再生植株的基因組中。通過離子束介導法將紫玉米的總DNA導入水稻品種早秈213,經連續6年12代的選育,獲得了一批穩定遺傳的變異株系,不僅根系發達,而且在莖干等部位表現出供體玉米的紫色性狀。測定了其中農藝性狀較好的8個株系的光合速率,平均比早秈213提高84%。用40個隨機引物對上述8個玉米稻株系以及早秈213和紫玉米的基因組DNA 進

13、行RAPD 分析,玉米稻DNA的RAPD擴增帶和早秈213的相似性很高,但存在明顯差異,出現來自玉米DNA的“目的帶”,提示玉米DNA可能已經整合到受體的基因組中。小麥:吳麗芳將水稻幾丁質酶基因在氬離子介導下注入小麥,得到高效表達幾丁質酶的小麥植株。在此基礎上,將改良的綠色熒光蛋白基因(mGFP4)導入小麥栽培品種皖9210和皖麥32的成熟胚細胞。在含有100120mg/L巴龍霉素培養基上繼代培養后,獲得了一批抗性愈傷組織。經過分化培養,獲得再生苗。對再生苗進行PCR 檢測,均擴增出600bp的npt基因片段。取4株長勢好的綠苗進行Southern雜交分析,結果表明,這4株綠苗皆為轉基因植株。

14、根據PCR分析結果統計,皖9210和皖麥32號的平均植株轉化率分別是1.3%和4.1%。用同樣的方法將水稻幾丁質酶基因RCH8轉入小麥品種皖9219和皖麥32的成熟胚中,經抗性篩選的再生植株當代(R0)及R1代均擴增出預期大小的DNA片段,Southern雜交證實外源基因已經整合到小麥基因組中；R1代葉片的細胞粗提液對小麥赤霉病菌株F 0和F15有明顯的抑制作用,說明外源基因在受體中穩定遺傳。其他作物:日本原子能研究所于1998年用碳離子(大氣環境中)介導將PCH基因轉入干的花粉細胞。將基因轉入花粉比轉入裸露的細胞更加困難,因為花粉細胞為雙層壁結構。同時,本實驗首次嘗試將束流引入室外,在大氣環

15、境中對生物材料進行注入。此后,科學家們進一步深入研究,轉移的外源基因也從以前的報告基因最終轉向目的基因。卞坡等利用30KeV的離子束在1.5×1017ions/cm2的注入劑量下介導外源甘藍全DNA導入模式植物擬南芥菜,在94株轉化當代植株中,有6株表型產生變異。宋道軍等以氯化鈣制備感受態受體細胞轉移法為對照,用離子束介導基因轉移技術,將具有高效DNA損傷修復系統的耐輻射異常球菌(D.radiodurans)的基因組DNA片段轉入對紫外(UV)輻照敏感的大腸桿菌中。結果表明,轉入DNA后的菌株對UV輻射的抗性不僅高于其對應的敏感菌株,而且也高于其對應的敏感菌株的產生菌株,表現為:轉入

16、DNA后的菌株受紫外輻照的存活率明顯提高,代表修復合成的非按期DNA合成(UDS)能力大為增強。中國科學院等離子體物理研究所與安徽農業科學研究院合作,用粒子束介導法將紫色玉米全DNA轉入水稻,獲得了3個玉米稻新品系,在區域試驗后將大范圍推廣。安徽農業大學用比克氏棉和紅麻DNA轉化泗棉2號,獲得了高抗枯萎病的棉花新品系。在這些實驗中,轉移的外源DNA能夠整合到受體基因組中,并能夠在后代中穩定遺傳。宋道軍等將銀杏DNA導入西瓜品種316和SR 221422中,銀杏內酯在西瓜品種316和SR221422的轉化當代葉片中的表達量分別為17.0756g/g和45.9998g/g;有銀杏內酯表達的兩個月齡

17、西瓜葉片超氧化物岐化酶活性,也分別比對照提高了近一倍,表明獲得了供體植物多基因在受體中的表達。離子束介導外源基因組DNA導入受體,可以篩選到帶有目的性狀的轉化后代,為遠緣和超遠緣物種間遺傳物質交流提供了一種新的有效途徑,且可以實現多基因的轉移和表達,顯示出在農作物育種上的美好應用前景。6.離子束介導轉基因技術研究現狀從目前的研究現狀來看,在利用低能離子束生物技術進行外源遺傳物質的轉化中,主要包括2個方面的研究內容,即低能離子束介導目的基因的遺傳轉化和離子束介導DNA大片段的遺傳轉化。大量的研究結果已經證實,低能離子束對生物體細胞的超微加工使得細胞的通透性會發生明顯的改變;通過對照射劑量進行控制

18、,可以在細胞和組織上形成可修復的微孔,這為外源遺傳物質進入細胞提供了良好的通道。經過近20年的不斷研究和探索,在離子束介導轉基因技術的發展過程中,離子束介導作用的異源遺傳物質重組效應已經被越來越多的試驗結果所證實,其實用性和普遍性也已經被相關領域的研究者所肯定,一些簡單的生物學問題已經被闡明,一些實用性技術體系已經建立并不斷得到完善。然而,離子束介導轉基因技術在今后的發展中仍然面臨著嚴峻的挑戰,還有一些更引人注目的問題值得研究,今后在該領域內的研究難度會隨著研究的不斷深入而越來越大。此領域迫切需要建立一個更加完善的物理技術平臺,急待形成一個更加完整的研究體系。有必要借助于其他學科的新技術或新工

19、藝形成一個相互補充的技術集成體系,更應該將離子束介導轉基因技術的實用性和普遍性的范圍不斷地拓寬。7.問題與展望雖然離子束介導轉基因方法在外源遺傳物質轉移方面獲得極大的成功,但這一新興的技術還有待于進一步完善。從近10多年來離子束介導轉基因技術的研究結果來看,學科內的研究資料尚缺乏系統性和完整性,即研究項目所涉及到的生物種類比較多,但對每一種生物的研究深度還比較膚淺;對某些生物物種內特定材料研究的比較多,而忽視了統一生物物種的不同基因型對離子束介導作用會表現不同的生物學效應；在通過離子束介導外源遺傳物質對生物受體進行遺傳改良的過程中,對其后代的表現型效應研究的比較多,而對其細胞學機理、生理生化基

20、礎和分子生物學機制的研究比較少。目前的裝置需要在真空下進行離子注入,而真空的脫水作用和真空導致的凍害,使注入后細胞或組織的存活率大大下降。不僅嚴重影響轉化的效率,而且限制了在動物和以無性繁殖為主的果木和蔬菜上的應用。對于不同的物種、不同基因型的材料,還需確定其適宜的轉化參數。此外,國內進行離子注入所用的劑量單位是ions/ cm2 ,并非國際通用的計量單位,造成這一具有自主知識產權的新技術較難在國外優秀刊物上發表。改進裝置,將離子束流引出真空是解決問題的關鍵,應建造一臺能量更高、能引出外束的新裝置。在目前條件下,為提高轉基因效率和擴大受體范圍,離子注入前用冷凍保護劑預處理是行之有效的方法。由于

21、低能離子束具有質荷能協同作用下的特殊生物學效應,它已在生物品種改良、生命起源和進化以及環境輻射生物學效應等多個理論和應用研究領域中獲得長足發展。通過離子束介導外源基因轉移已獲得了一大批生物優良品系,取得了顯著的社會經濟效益,應用前景十分廣闊。作為一門新的交叉學科,低能離子生物學將隨著研究的不斷深入,進一步完善其理論體系,拓展其應用研究領域,開創新的研究局面。可以預見,隨著離子束生物技術的不斷發展,離子束介導轉基因技術將在更多的生物上得到應用,在外源基因組DNA轉移方面取得突破性進展。知識創新工程為這一領域的發展提供了極好的機遇,相信在生物學家和物理學家的共同努力下,這一領域的發展前景將會更加廣闊。參考文獻:1余增亮.離子束與生命科學一個新的研究領域J.物理,1997,26(6): 333-338.2Yu Z L,Deng J G, He J J , et al. Mutation breeding by ion im2p lantation J.Nuclear Instruments and Methods in Physics Research,1991,B59 /60: 705 -708.3吳麗芳,李紅,宋道軍. 建立低能離子束介導小麥轉基因方法并獲得轉GUS基因植株J.遺傳學報,2000,27(11):982-991.4吳麗芳,李紅,宋道君等.低能氬離