1、多肽的制備及其功能活性的研究進(jìn)展摘要：科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)存在多種具有生理活性的多肽物質(zhì)，它們具有不同的結(jié)構(gòu)和功能活性。人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收。幾乎所有細(xì)胞都受多肽調(diào)節(jié)，它具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能和為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)的雙重成效。人們已從包括人、植物、動(dòng)物在內(nèi)的各種生物體中別離出各類活性多肽，并且對(duì)多肽的性質(zhì)、制備方法、別離純化方法、鑒定技術(shù)、功能活性及應(yīng)用等方面進(jìn)行了大量的研究，并取得了一定的成效。本文介紹了活性多肽的制備方法及其活性研究現(xiàn)狀，對(duì)多肽的多種功能活性進(jìn)行了介紹，概述了不同來(lái)源多肽的制備方法和其功能活性研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞：多肽；功能活性；別離純化前言近年來(lái)，多肽

2、在生物體內(nèi)的生理功能受到越來(lái)越多的重視。大量研究結(jié)果說(shuō)明，蛋白質(zhì)由于其分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，攝人人體后不易被消化吸收，從而影響了其生理功能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的有效發(fā)揮。多肽是比蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分子量小，由216個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接的一類化合物，按氨基酸組成數(shù)目可人為分為短肽（25個(gè)氨基酸），多肽（616個(gè)氨基酸）。多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。科學(xué)發(fā)現(xiàn)，幾乎所有細(xì)胞都受多肽調(diào)節(jié)，如：細(xì)胞分化、神經(jīng)激素遞質(zhì)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等均與活性多肽密切相關(guān)，它具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能和為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)的雙重成效。由于多肽具有調(diào)節(jié)植物神經(jīng)系統(tǒng)、活化細(xì)胞免疫機(jī)能、改善心血管功能和抗衰老等生理活性，這為開發(fā)肽藥物、

3、肽類保健食品提供了理論依據(jù)。可見(jiàn)，進(jìn)行多肽的研究和開發(fā)有著十分重要的研究意義和應(yīng)用前景111o一，多肽的制備方法目前，國(guó)內(nèi)外制備多肽的方法主要有：蛋白酶水解法、化學(xué)合成法、基因重組法、別離提取法等。酶法生產(chǎn)功能性多肽應(yīng)用較為普遍。龔吉軍等人3利用茶籽蛋白酶酶解制備菜籽多肽，確定了最正確條件，此條件下氨基酸態(tài)氮生成率可達(dá)34.64%,制備的茶籽多肽對(duì)超氧自由基和羥基自由基具有強(qiáng)烈的去除作用；李書國(guó)等人4研究了酶法生產(chǎn)大豆多肽的加工工藝，別離得到純潔的酸性水解物溶液，水解率高達(dá)95%;班玉鳳等人5研究了Alcalase水解大豆蛋白制備大豆蛋白寡肽的方法，確定了酶解的最正確條件，其水解液的水解度到達(dá)

4、了24.1%;劉大川等也利用堿性蛋白酶對(duì)富硒菜籽別離蛋白酶解制備蛋白肽，水解度達(dá)32.51%,制得的富硒菜籽蛋白肽分子量分布較好，幾乎完全是小分子多肽，分子量均在1500必下。以下是幾種方法優(yōu)缺點(diǎn)的概述。1,化學(xué)水解：酸解，堿解，酸解法水解度不易控制，容易使氨基酸遭到破壞；堿解法能使L-氨基酸形成D-氨基酸，可能存在營(yíng)養(yǎng)和毒理方面有害的效應(yīng)，對(duì)于食品多肽的生產(chǎn)缺乏取。所以這兩種方法都很少被使用破壞L型氨基酸，2,酶法水解：能在一定條件下進(jìn)行定位水解產(chǎn)生特定的肽，且易于控制水解進(jìn)程，并且具有高度的專一性，一般不會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)方面的損失，也不會(huì)產(chǎn)生毒理學(xué)上的問(wèn)題，同時(shí)酶作用具有特異性，可在溫和條件下進(jìn)

5、行，因而能較好的滿足肽的生產(chǎn)需要。3,發(fā)酵法：直接利用微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶降解蛋白，可到達(dá)較高的水解率，該技術(shù)的要求相對(duì)較高，對(duì)菌種的依賴性較大，本質(zhì)也是酶解。目前采用較多的是酶法。酶法因其水解條件溫和，水解度易控制，無(wú)環(huán)境污染的特點(diǎn)，備受推崇。而酶解法中雙酶或多酶協(xié)同水解的方式又多被采用。因?yàn)檫@種方式生產(chǎn)下的水解液水解度大、苦味低、多肽種類多。現(xiàn)在蛋白質(zhì)的水解一般都用酶法水解，在多肽的生產(chǎn)中酶的選擇是關(guān)鍵，它不僅影響最后產(chǎn)品的得率，反響速度，而且直接影響產(chǎn)品的風(fēng)味和理化特性，現(xiàn)有的酶解工藝多采用單酶水解，易產(chǎn)生苦，澀等不良風(fēng)味影響了食用的要求，因此通常采用復(fù)合酶水解，例如：內(nèi)肽酶和端

6、肽酶，alcalase與flavourzyme得組合酶等。在蛋白質(zhì)的酶解過(guò)程中水解度的控制是十分重要的參數(shù)因?yàn)檫^(guò)度的水解會(huì)產(chǎn)生苦味肽，影響水解蛋白在食品中的應(yīng)用。多肽制備的一般步驟：原料-前處理-提蛋白-枯燥-蛋白粉-酶解-滅酶-離心別離-多肽液-枯燥-多肽粉。二，多肽含量的測(cè)定1.雙縮月尿法雙縮月尿反響：在強(qiáng)堿性溶液中雙縮月尿與硫酸銅反響可生成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，在54彷內(nèi)米處測(cè)吸光值。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵都可發(fā)生雙縮月尿反響2.OP峨鄰苯二甲醛法；使用于乳源性的多肽測(cè)定，反響試劑：含有25m1100mM的硼砂2.5m120（w/w）SDS40ragOP

7、A部苯二甲醛溶于1ml甲醇、1o01p一航基乙醇用去離子水定容至50ml,用不同濃度的胰蛋白酶水解的酪蛋月東（多肽）來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，50/11樣品溶液與2ml試劑室溫下反響2rain,在340nm下比色，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可以得到多肽的含量。3.紫外吸收法；蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比，所以此法適用于多肽的含量測(cè)定。因此可以用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制一系列5拆500fg/ml濃度的5.0ml蛋白質(zhì)溶液，測(cè)定238nm的光吸收值A(chǔ)238,以A23的縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品的濃度即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。多種有機(jī)物，如醇、酮、醛、醍、有機(jī)酸、酰胺類和過(guò)氧化物

8、等都有干擾作用。所以最好用無(wú)機(jī)鹽，無(wú)機(jī)堿和水溶液進(jìn)行測(cè)定。假設(shè)含有有機(jī)溶劑，可先將樣品蒸干，或用其他方法除去干擾物質(zhì)，然后用水、稀酸和稀堿溶解后再作測(cè)定。三多肽的別離純化隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的開展，用于蛋白質(zhì)及多肽別離純化的方法日益先進(jìn)。常用的提取別離法包括：化學(xué)萃取法（如：醇法、丙酮法）、陰陽(yáng)離子交換吸附柱、Sephadexi!膠過(guò)濾柱、凝膠電泳、高效液相色譜（HPLC）、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE痔方法。Cher人9利用水醇提取法，結(jié)合離子交換、凝膠過(guò)濾和RP-HPL以人參中別離到六種含僅氨基酸的小肽。郝林琳等人10采用醋酸溶液和乙醇提取了6支鮮二杠馬鹿茸的主干頂部、中部、根部3個(gè)部位的多肽。

9、金聲等人11將罌粟的花粉水提取液經(jīng)H理陽(yáng)離子交換柱，Sephadex膠過(guò)濾柱和HPL臻統(tǒng)提取別離得到了四種多肽。1 四多肽的活性研究.易消化吸收作用過(guò)去人們認(rèn)為，人體主要是以氨基酸的形式吸收蛋白質(zhì)，但現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)消化道中的酶水解后，主要以寡肽的形式被消化吸收，以游離氨基酸形式吸收的比例很小，所以，多肽比完全游離氨基酸更易更快地被機(jī)體吸收利用，且蛋白質(zhì)以多肽的形式被吸收，也有利于最大限度地利用其生物活性功能。尤其對(duì)于消化功能受損的人群，他們的食物蛋白質(zhì)的吸收受到嚴(yán)重限制和影響，蛋白質(zhì)、氨基酸循環(huán)被破壞，體內(nèi)不能合成多肽，假設(shè)直接服用多肽即可補(bǔ)充蛋白質(zhì)，又可以維持正常的代謝

10、平衡。2 .降血壓作用3 AcEI抑制肽能抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的活性，而血管中的AcBfg使血管緊張素II生成，從而引起末梢血管收縮致使血壓升高。可見(jiàn)AcEI抑制肽能夠間接阻止血管緊張素H的生成，進(jìn)而起到降低人體血壓的作用，是預(yù)防和治療高血壓的有效多肽類物質(zhì)。江南大學(xué)劉萍等人利用酶法水解玉米蛋白粉生產(chǎn)降血壓肽，結(jié)果說(shuō)明堿性蛋白酶水解玉米蛋白獲得的水解液在水解度為15.96%時(shí)水解液的ACE卬制率最高，IC50值為0.125mgmlI。張族等人利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶分別水解大豆蛋白，制備具有AC抑制活性的大豆多肽，結(jié)果說(shuō)明堿性蛋白酶是最正確的水解酶，

11、當(dāng)酶與底物比為2.0,反響時(shí)間為80分鐘，溫度為55c時(shí)可制備出高ACE卬制活性的大豆多肽1131o.降血脂和降膽固醇作用人們?cè)缭?0世紀(jì)初就觀察到植物蛋白的水解產(chǎn)物蛋白肽具有比植物蛋白本身更有效的降血脂、降膽圄醇的作用。有研究分析，多肽能刺激甲狀腺激素分泌增加，促進(jìn)了膽固醇的膽汁酸化，使糞便排泄膽固醇增加，從而起到降低血液膽固醇的作用。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)說(shuō)明：大豆多肽中，分子相對(duì)質(zhì)量大于5000D勺局部具有明顯降低膽固醇的作用；并且只對(duì)膽固醇值高的人有降低膽固醇的作用，對(duì)正常人沒(méi)影響心。4 .抗茵作用抗菌肽又稱為微生物肽或肽抗生素，是指存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界微生物侵害，消除體內(nèi)突變細(xì)

12、胞的一類由生物細(xì)胞特定基因編碼產(chǎn)生的小分子多肽。抗菌肽是動(dòng)物機(jī)體具有天然免疫力的重要原因，對(duì)動(dòng)物的非獲得性免疫具有特殊意義。它們的堿性基團(tuán)和微生物的細(xì)胞膜有著很強(qiáng)的親和性，可通過(guò)增加細(xì)胞膜的通透性殺死微生物。西南大學(xué)食品學(xué)院霍健聰?shù)热耍阂詭~下腳料為原料，制備多肽亞鐵螯合物，并研究亞鐵鰲合物的抑茵活性14。利用風(fēng)味酶和動(dòng)物復(fù)合蛋白酶雙酶法制備水解液，采用氯化亞鐵螯合。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等為測(cè)試菌株，采用牛津杯雙層平板法確定亞鐵螯合物的抑茵中濃度及探討pHffi溫度對(duì)亞鐵螯合物抑菌活性的影響。結(jié)果說(shuō)明：（1）最正確酶解條件為帶魚下腳料蛋白用量4.1g/100mL,溫度4OC,復(fù)合比1:1

13、,酶量6X10IU/100mL,pH7;(2)帶魚下腳料蛋白最正確螯合條件為：pH7,時(shí)間15min,溫度20c,抗壞血酸用量0.1%;(3)抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：亞鐵螯舍物對(duì)所選取的測(cè)試菌株除普通變形桿菌外都有一定抑菌作用，其中對(duì)巨大芽胞桿菌抑茵效果最好；在酸性條件下抑茵活性仍然較高，但在堿性環(huán)境中抑菌活性明顯降低；在較低溫度下保持抑茵活性，但高溫處理后抑菌活性顯著降低。亞鐵螯合物對(duì)各測(cè)試菌株除普通變形桿菌之外均有較強(qiáng)的抑菌活性，是一種對(duì)細(xì)菌較為廣譜的抑菌劑。5 .抗氧化作用抗氧化性多肽是生物活性肽的一種。抗氧化機(jī)理包括通過(guò)給抗氧化酶提供氫、緩沖生理pH螯合金屬離子和捕捉自由基等途徑起到抗氧

14、化作用。科學(xué)研究說(shuō)明自由基可引起蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化、核酸損傷等，進(jìn)而誘發(fā)各種疾病。而抗氧化多肽具有去除自由基、防止脂質(zhì)過(guò)氧化等作用，將其添加到功能保健食品中，具有預(yù)防多種疾病的作用。抗氧化性多肽還能作為天然抗氧化劑防止油脂氧化，緩衰老的作用。河南工業(yè)大學(xué)史軍，王金水等人15利用花生蛋白經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶ALCALASE復(fù)合蛋白酶PROTAMEX軍得到活性肽溶液.通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)得到各個(gè)因素的優(yōu)化組合，并進(jìn)一步研究活性肽的抗氧化特性.結(jié)果說(shuō)明，ALCALAsE花生蛋白的水解能力優(yōu)于PROTAME難生肽具有較強(qiáng)的抗氧化性及有效去除羥自由基的能力。6.促進(jìn)礦物質(zhì)吸收；某些蛋白肽可通過(guò)與人體必

15、需的礦物離子形成螯合物，使鈣、鐵等離子維持在可溶狀態(tài)，從而促進(jìn)機(jī)體對(duì)礦物質(zhì)的吸收。如將從牛乳中提取的酪蛋白磷酸肽CPP也稱為促鈣吸收肽，添加到兒童和婦女及老年食品中，那么可促進(jìn)鈣的吸收。近一個(gè)世紀(jì)的研究說(shuō)明，肽是由20個(gè)天然氨基酸以不同的組成和排列方式構(gòu)成的二肽到復(fù)雜的線性和環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類總稱，是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物。活性肽廣泛存在于自然界中，生物體很多活性物質(zhì)都以肽的形式存在，沒(méi)有肽，就沒(méi)有活性，沒(méi)有生命16。科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)了具有免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、酶調(diào)節(jié)、抗病毒、降血壓和降血脂等功能性肽17叫。由于功能性肽的特殊功能，使得人們對(duì)它的需求增加，現(xiàn)在已提取出的多種功能性肽多用于醫(yī)用和

16、保健，如功能性大豆蛋白肽已經(jīng)用于降血脂。伴隨著需求，人們對(duì)肽的結(jié)構(gòu)和功能研究也逐漸深入。參考文獻(xiàn)1勵(lì)建榮，封平.功能肽的研究進(jìn)展.食品科學(xué)，2004,25(11):4154192孔令明，等.多肽的功能活性與研究進(jìn)展J.中國(guó)食品添加劑2021,03,71-73.3龔吉軍。李忠海，鐘海雁，等.茶籽多肽的制備及抗氧化活性研究.食品研究與開發(fā)，200r7,28(10):59614李書國(guó)，陳輝，杜進(jìn)民，等.大豆多肽的功能特性及加工工藝.糧油食品科技，2000,8(1):14155班玉鳳，朱海峰，孫明珠.Alc出00水解大豆蛋白制備大豆蛋白寡肽的研究.現(xiàn)代食品科技。20cr7,23(11):5l536劉大

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