1、.實驗一實驗一. 能夠說出蛋白質變性、凝固反應的原理及實驗方法能夠說出蛋白質變性、凝固反應的原理及實驗方法 能夠說出蛋白質沉淀反應的原理及實驗方法能夠說出蛋白質沉淀反應的原理及實驗方法 能夠運用鹽析法及重金屬沉淀法能夠運用鹽析法及重金屬沉淀法.蛋白質的加熱變性凝固蛋白質的加熱變性凝固蛋白質沉淀反應蛋白質沉淀反應蛋白質鹽析蛋白質鹽析重金屬鹽沉淀蛋白質重金屬鹽沉淀蛋白質生物堿試劑沉淀蛋白質生物堿試劑沉淀蛋白質.(denaturation) 在某些理化因素的作用下，蛋白質嚴格的空間結構在某些理化因素的作用下，蛋白質嚴格的空間結構被破壞（不包括肽鍵的斷裂），從而引起若干理化性質被破壞（不包括肽鍵的斷裂

2、），從而引起若干理化性質和生物學性質改變的現象。和生物學性質改變的現象。.變性后的蛋白質稱變性后的蛋白質稱變性蛋白變性蛋白,能使蛋白質變性能使蛋白質變性的物質叫的物質叫蛋白質變性劑蛋白質變性劑。變性因素變性因素物理因素物理因素高溫高溫、高壓、高壓紫外線、紫外線、X射線、射線、電離輻射和超聲波等電離輻射和超聲波等化學因素化學因素強酸、強堿強酸、強堿有機溶劑、有機溶劑、重金屬鹽重金屬鹽高濃度尿素、鹽酸胍等高濃度尿素、鹽酸胍等變性實質：變性實質： 破壞了空間結構，一級結構不受影響（分子組成、破壞了空間結構，一級結構不受影響（分子組成、分子量不變）。分子量不變）。.可逆變性：除去變性因素，蛋白質空間結

3、構可可逆變性：除去變性因素，蛋白質空間結構可以恢復原狀。以恢復原狀。不可逆變性：除去變性因素，蛋白質空間結構不可逆變性：除去變性因素，蛋白質空間結構不能恢復原狀。不能恢復原狀。消滅病原微生物消滅病原微生物蛋白質制劑的保存蛋白質制劑的保存保護體內蛋白質保護體內蛋白質. 蛋白質分子顆粒大小蛋白質分子顆粒大小1-100nm之間之間,屬膠體顆屬膠體顆粒范圍，在溶液中能形成穩定的膠體。粒范圍，在溶液中能形成穩定的膠體。原因原因表面形成水化層表面形成水化層表面同種電荷的斥力表面同種電荷的斥力除去這兩個因素，就會發生沉淀。蛋白質分除去這兩個因素，就會發生沉淀。蛋白質分子相互聚集而從溶液中析出的現象稱為子相互

4、聚集而從溶液中析出的現象稱為沉淀沉淀。+.+-蛋白質膠體顆粒的沉淀 帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質酸酸酸酸堿堿堿堿脫水脫水脫水脫水脫水脫水不穩定的蛋白質顆粒 （沉淀）帶正電荷的蛋白質 （疏水膠體）帶負電荷的蛋白質 （疏水膠體）堿堿酸酸（親水膠體）（親水膠體）（親水膠體）-.結構和性質都不變結構和性質都不變適當條件下可重新溶解適當條件下可重新溶解是分離和純化的基本方法是分離和純化的基本方法結構和性質都發生變化結構和性質都發生變化沉淀不再溶解于水沉淀不再溶解于水.蛋白質變性沉淀并凝聚成塊狀稱為蛋白質變性沉淀并凝聚成塊狀稱為凝固凝固。不可逆變性狀態不可逆變性狀態.變性屬于蛋白質本質

5、的變化，沉淀和凝固屬于變性屬于蛋白質本質的變化，沉淀和凝固屬于一種現象一種現象變性不一定沉淀，變性蛋白質只在等電點附近變性不一定沉淀，變性蛋白質只在等電點附近才沉淀才沉淀變性蛋白易于沉淀，變性蛋白易于沉淀， 沉淀蛋白不一定變性沉淀蛋白不一定變性沉淀的變性蛋白質也不一定凝固沉淀的變性蛋白質也不一定凝固.蛋白質分子受蛋白質分子受熱熱作用，分子空間結構變化，疏作用，分子空間結構變化，疏水基團暴露于分子表面，溶解度降低。水基團暴露于分子表面，溶解度降低。當蛋白質分子當蛋白質分子不帶電荷不帶電荷（處于（處于等電點等電點條件下），條件下），則蛋白質發生聚集則蛋白質發生聚集出現沉淀；出現沉淀；當蛋白質當蛋白

6、質分子帶電分子帶電（處于（處于非等電點非等電點條件下），條件下），則蛋白質因靜電排斥作用而則蛋白質因靜電排斥作用而不出現沉淀不出現沉淀；. 取三只小玻璃試管，各加入取三只小玻璃試管，各加入10%蛋白質溶液蛋白質溶液10d，分別標記為分別標記為1、2和和3號管；號管；1.向向1號管號管中加入：中加入：pH4.8緩沖液緩沖液10d 。混勻，于酒精燈。混勻，于酒精燈上緩慢加熱至沸點，觀察變化（上緩慢加熱至沸點，觀察變化（ ）；）；高溫下，蛋白質發生不可逆的變性并凝固。高溫下，蛋白質發生不可逆的變性并凝固。.向向2號管號管中加入：中加入：H2O 8d, 0.1mol/L HCl 2d。混勻，。混勻，于

7、酒精燈上緩慢加熱至沸點，觀察變化（于酒精燈上緩慢加熱至沸點，觀察變化（ ） 停止加熱，向停止加熱，向2號管號管中中逐滴逐滴加入：加入：0.1mol/L NaCO3 。搖勻后繼續滴加，搖勻后繼續滴加，一旦出現絮狀物即停止。一旦出現絮狀物即停止。 將將2號管號管于酒精燈上加熱，觀察現象（于酒精燈上加熱，觀察現象（ ） 冷卻后，再加入：冷卻后，再加入： 0.1mol/L HCl 2d。觀察現象。觀察現象（ ）蛋白質變性不一定出現沉淀；蛋白質變性不一定出現沉淀；蛋白質變性后在特定條件下發生沉淀；蛋白質變性后在特定條件下發生沉淀；沉淀加熱后發生不可逆變性并凝固。沉淀加熱后發生不可逆變性并凝固。.向向3號

8、管號管中加入：中加入：H2O 8d, 0.1mol/L NaOH 2d。混勻，。混勻，于酒精燈上緩慢加熱至沸點，觀察變化（于酒精燈上緩慢加熱至沸點，觀察變化（ ）；）； 停止加熱，向停止加熱，向3號管號管中中逐滴逐滴加入：加入：0.1mol/L HAC。一。一旦出現絮狀物即停止。旦出現絮狀物即停止。 繼續滴加：繼續滴加：0.1mol/L HAC 1d。觀察現象（。觀察現象（ ） 將將3號管號管于酒精燈上加熱，觀察現象（于酒精燈上加熱，觀察現象（ ） 向向3號管中加入：號管中加入： 0.1mol/L NaOH 。一旦出現絮狀物。一旦出現絮狀物即停止。即停止。 將將3號管號管于酒精燈上加熱，觀察現

9、象（于酒精燈上加熱，觀察現象（ ） 冷卻后，再加入：冷卻后，再加入： 0.1mol/L NaOH 2d。觀察現象。觀察現象（ ）蛋白質變性不一定出現沉淀；蛋白質變性不一定出現沉淀；蛋白質變性后在特定條件下發生沉淀，并可逆；蛋白質變性后在特定條件下發生沉淀，并可逆；.蛋白質的蛋白質的鹽析鹽析一定濃度中性鹽一定濃度中性鹽 （ (NH4)2SO4、Na2SO4等）可去等）可去除蛋白質分子所帶電荷及其表面的水化層，從而使除蛋白質分子所帶電荷及其表面的水化層，從而使蛋白質從溶液中聚集沉淀出來。利用這個原理使蛋蛋白質從溶液中聚集沉淀出來。利用這個原理使蛋白質從溶液中沉淀出來的方法為白質從溶液中沉淀出來的方

10、法為鹽析鹽析。不同蛋白質鹽析時所需的鹽濃度不同，可以通過不不同蛋白質鹽析時所需的鹽濃度不同，可以通過不同濃度鹽溶液分離不同蛋白質，就是同濃度鹽溶液分離不同蛋白質，就是分段鹽析分段鹽析。大部分蛋白質都可用大部分蛋白質都可用飽和飽和(NH4)2SO4溶液鹽析出來。溶液鹽析出來。某些蛋白質在某些蛋白質在半飽和半飽和(NH4)2SO4溶液中析出。溶液中析出。鹽析是一個鹽析是一個可逆沉淀反應可逆沉淀反應。.取一只小玻璃試管，加入取一只小玻璃試管，加入2mL蛋白質溶液；蛋白質溶液；加入等體積加入等體積飽和飽和(NH4)2SO4溶液，混勻后靜置溶液，混勻后靜置3min。觀察現象（觀察現象（ ）對該溶液進行過

11、濾，將濾液收集于一只干凈試管中，對該溶液進行過濾，將濾液收集于一只干凈試管中，取部分轉入另一只試管中；取部分轉入另一只試管中；向一只試管中加入向一只試管中加入結晶結晶(NH4)2SO4粉末粉末，直到粉末不，直到粉末不再溶解（成為再溶解（成為飽和飽和(NH4)2SO4溶液）；溶液）；比較兩只試管現象（比較兩只試管現象（ ）.重金屬鹽沉淀蛋白質重金屬鹽沉淀蛋白質在堿性條件下，重金屬離子與蛋白質結合成不溶性在堿性條件下，重金屬離子與蛋白質結合成不溶性蛋白鹽而沉淀。蛋白鹽而沉淀。取一只小玻璃試管，加入取一只小玻璃試管，加入1mL蛋白質溶液；蛋白質溶液；加入加入0.1mol/mL NaOH 2d，混勻；，混勻；逐滴加入逐滴加入CuSO4，搖勻，直至出現沉淀為止。，搖勻，直至出現沉淀為止。.生物堿試劑沉淀蛋白質生物堿試劑沉淀蛋白質在酸性條件下，蛋白質可與生物堿試劑在酸性條件下，蛋白質可與生物堿試劑(如苦味酸、如苦味酸、鎢酸、鞣酸鎢酸、鞣酸)以及某些酸以及某些酸(如三氯醋酸、過氯酸、硝如三氯醋酸、過氯酸、硝酸酸)結合成不溶性的鹽沉淀，此時蛋白質帶正電荷結合成不溶性的鹽沉淀，此時蛋白質帶正電荷易于與酸根負離子結合成鹽。易于與酸根負離子結合成鹽。 取一只小玻璃試管，加入取一只小玻璃試管，加入1mL蛋白質溶液；蛋白質溶