1、輻射對神經細胞移動     本文作者：邱 俊、蔡二朋、吳翠萍、王明明                                   單位： 安徽醫科大學臨床醫學院放射醫學研究所、安徽醫科大學放射醫學研究所中樞神經系

2、統因其特殊性，其輻射生物效應的研究歷來受到人們的重視。國際放射防護委員會（ICRP）和聯合國原子輻射效應科學委員會（UNSCEAR）曾對有關胚胎和胎兒受照影響中樞神經系統發育的人類資料和動物實驗資料進行了全面綜述和評論1，2，證明輻射能以損傷神經元前體細胞、影響神經元遷移及其通道分化、神經元間正確聯系及神經元的分布等多種方式干擾腦發育,使其結構異常,機能發育延遲和低下。而細胞遷移涉及鈣離子濃度、細胞骨架與細胞外基質變化3。本實驗從細胞內游離鈣離子濃度、微管和神經細胞粘附分子表達改變等角度來研究輻射對神經元細胞遷移的影響，以深入了解輻射所致腦損傷機理，為防治這種損傷提供重要實驗依據。1材料和方法

3、1.1實驗動物出生24小時內的SD新生鼠由安徽醫科大學實驗動物中心提供。1.2細胞與試劑DMEM/F12（11）和B27購于Gibco公司;bFGF、EGF、MAP2抗體購于Sigma公司；Fluo-3/AM（美國分子探針公司）；培養板（6孔、24孔、96孔，美國Falcon公司）；小鼠抗大鼠-微管蛋白（-tubulin）抗體，NCAM單克隆抗體（OBl1，Sigma公司）；HRP標記的羊抗小鼠IgG購于北京中杉金橋生物工程公司。1.3細胞的原代分離培養取新生1天SD大鼠，無菌條件下分離雙側海馬，剪碎，加0.25%胰蛋白酶消化（37，30min）然后用胎牛血清終止消化；彎頭滴管輕輕吹打10次，

4、以800r/min離心10min，棄上清，重新懸浮細胞，過200目篩網，調整細胞濃度為5×105/mL種植于預先涂有多聚賴氨酸的24孔板和60mm培養皿,培養基為DMEM/F12(含10%胎牛血清、2%B27，bFGF20g/mL，EGF20g/mL),置于37，5%CO2，飽和濕度的孵育箱內培養;接種第3天加入終濃度為5mol/LAra-c作用48小時,抑制神經膠質細胞的增殖。1.6神經元胞漿內游離Ca2+測定用0.25胰蛋白酶消化法制備細胞懸液。0.1mol/mLPBS洗滌2次,取細胞懸液lmL，加Fluo-3/AM至終濃度為5mol/L，置CO2培養箱，避光孵育1小時，其間輕輕

5、振蕩幾次。取細胞懸液，離心，棄上清。0.1mol/mLPBS洗滌3次，最后用PBS重懸至0.5mL，流式細胞儀檢測，激發波長為506nm，發射波長為526nm。隨機測定單個神經元的熒光強度值，取其平均值為各組測定值。實驗重復3次，設4個平行樣。結果以WinMDI2.9軟件分析處理,利用熒光強度的大小來相對反映細胞內游離鈣離子濃度的大小。1.7Westernblot檢測收集HTO處理過的細胞。提取細胞總蛋白，經考馬斯亮蘭G-250染色法定量蛋白。灌制7分離膠和5濃縮膠，取30L總蛋白上樣，經十二烷基苯磺酸鈉一聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶封閉；分別與一抗

6、-tubulin（1500）和NCAM單克隆抗體（1800）孵4過夜；加二抗（15000）室溫孵育1小時；發光顯影，定影晾干，同時以GAPDH作為內參對照。圖像分析：分別對實驗組的Westernblot結果進行圖像掃描，各組隨機抽取10張掃描圖像，以GAPDH蛋白表達條帶作為目的帶進行IOD測定，然后根據目的蛋白表達的IOD與GAPDH蛋白表達的IOD比值作為相對量進行統計學處理。實驗重復3次，設4個平行樣。1.8統計學處理所得數據表示為均值±單次測量標準差，采用SPSS13.0軟件進行統計分析，各組之間進行兩獨立樣本t檢驗。2實驗結果2.1氚輻射對神經細胞遷移的影響不同劑量氚水照后

7、8小時神經細胞遷移的距離列于表1。由表1可見，氚水濃度在03.7×106Bq/mL，神經細胞的遷移距離呈現劑量依賴性縮短,均明顯小于對照（p<0.05）。2.2氚輻射對Ca2+濃度的影響照后24小時，用Fluo-3/AM標記腦海馬神經元，以流式細胞儀測定細胞內熒光強度來間接反映細胞內Ca2+濃度，結果示于圖1。由圖1可見，隨著氚水照射劑量的增大，受照細胞內熒光強度分別為42.83±6.38、55.64±9.15、58.19±7.24、80.27±9.67，均明顯高于對照組（25.59±8.92，p<0.05），呈劑量依賴性

8、增加。表明加入氚水后，細胞內游離鈣離子增多。2.3氚輻射對-tubulin表達的影響結果示于圖2。由圖2可見，隨著氚輻射劑量的增大，各組細胞內-tubulin蛋白含量逐漸降低，-tubulin與GAPDH蛋白OD值之比分別為2.057±0.096、1.849±0.126、1.737±0.12、1.181±0.308、0.920±0.262。2.4氚輻射對NCAM表達的影響結果示于圖3。由圖3可見，隨著輻射劑量的增大，各組細胞NCAM蛋白表達量逐漸降低，NCAM與GAPDH蛋白OD值之比分別為0.436±0.032、0.401±

9、;0.013、0.381±0.026、0.232±0.047、0.132±0.031。受照神經元細胞內的NCAM含量明顯低于對照（p0.05）。3討論神經細胞的遷移是神經系統發育中的一個重要環節，研究輻射影響神經細胞遷移的分子機制有助于深入了解腦輻射損傷。輻射對腦損傷的研究以前主要集中在輻射對大腦皮層和海馬結構的組織、細胞及大腦內蛋白質水平的損傷效應及這些損傷與輻射所致腦機能障礙之間的關系4-6。但低劑量輻射妨礙神經元細胞遷移及其分子機制的相關資料相當缺乏，本實驗通過從鈣離子、細胞骨架和神經細胞粘附分子等三方面來深入研究輻射影響神經細胞遷移的相關分子機制。結果證實

10、電離輻射可使神經細胞遷移發生顯著改變。電離輻射作用于神經元細胞，引起鈣離子內流，從而激活一系列信號通道，引起相關分子如細胞骨架蛋白和神經細胞粘附分子的變化，影響神經元遷移。鈣離子是神經細胞信息傳遞及神經遞質合成與釋放重要的細胞內第二信使。神經細胞內一定濃度的游離Ca2+對維持細胞正常的生理活動包括細胞遷移起著重要的作用。Ca2+通道有細胞溶質蛋白因此具有緩沖能力，所以Ca2+內流可在進入位點周圍產生局部信號。局部信號隨Ca2+內流逐漸增多而產生一系列的增大效應，以至于細胞膜系（內質網）的其他一些離子通道開放，引起胞內一系列的反應。研究發現在神經元遷移和軸突生長過程中有Ca2+的信號表達。在上皮

11、角質細胞和小腦神經元細胞遷移過程中Ca2+作用不同，故其濃度分布也迥然不同3。在其他實驗中同樣也發現神經元內游離Ca2+的增多，可以刺激介導神經元細胞遷移相關的細胞骨架蛋白的變化3，7。本研究發現，與對照相比，受氚水照射后細胞游離Ca2+的含量均有改變。隨著照射劑量的增加，神經細胞內游離Ca2+的含量呈上升趨勢。電離輻射直接作用于神經細胞，可引起Ca2+大量內流，激活鈣依賴性蛋白酶（calpain），使細胞骨架蛋白降解，影響神經細胞遷移8。細胞骨架是構成細胞的物質基礎，而微管蛋白是神經細胞骨架成分微管的重要組成部分，它具有神經特異性，是最早的神經元標志物之一。受照后，微管蛋白上有一些重要的與微

12、管功能密切相關的巰基基團被氧化,影響這些基團所在區域構象改變,妨礙微管聚合。同時電離輻射可誘發微管相關蛋白激酶失活，致使微管相關蛋白（MAP）磷酸化，失去結合微管的能力，因為MAP參與微管的組裝及結構的穩定,當MAP被磷酸化后失去結合微管的能力,從而使微管處于不穩定狀態9-12。微管構成細胞內的網狀支架，支持和維持細胞的形態，是細胞骨架的主要成分之一，參與細胞分裂、遷移和極化。細胞遷移時微管被極化，促進與遷移有關物質的運輸，有利于整個細胞的極化和遷移進行。資料證實，NUDF（NuclearDistributionF）人類同系物LIS1（1issencephalyprotein1）、NUDE與微

13、管或其他細胞骨架相關蛋白動力蛋白、動力肌動蛋白共同控制細胞的遷移運動13，14。本實驗Westernblot結果表明，隨著HTO輻射劑量的增加，神經元細胞骨架蛋白-tubulin的灰度值呈下降趨勢，證實輻射影響微管蛋白表達。故電離輻射使微管處于不穩定狀態，妨礙微管的聚合，從而阻止神經元細胞的遷移。NCAM屬于粘附分子免疫球蛋白超家族成員之一，NCAM可以通過參與同源性(NCAM-NCAM)和異源性（NCAM和一系列蛋白包括成纖維生長因子受體、神經細胞粘附分子L1和不同類型的膠原和蛋白聚糖）細胞間相互作用來調節神經細胞軸突生長、遷移15，16。這種細胞間相互作用過程可能與成纖維細胞生長因子（FGF）受體可激活細胞內的信號傳導途徑有關。FGF受體上含有細胞粘附分子的同源結構域（CHD）。NCAM可能通過與CHD上的NCAM同源結構域結合來調節FGF受體活性。本研究發現神經細胞受照后，NCAM隨氚輻射劑量增加而表達減少，從而影響神經細胞遷移。當電離輻射作用于神經細胞時，誘導大量Ca2+內流，激活磷脂酶C（PLC）產生甘油二酯（DAG），此時FGF受體可能受到負反饋調節作用，活性受到抑制，從而抑制神經細胞遷移15-17。