1、螺旋藻多糖對HSV                 【摘要】 目的 探討鈍頂螺旋藻多糖(PSP)對HSV-2糖蛋白gB mRNA表達的影響及其機制，為進一步開發(fā)該藥提供理論依據。方法 以不同劑量的PSP作用于HSV-2感染的Vero細胞，應用地高辛標記寡核苷酸探針，檢測HSV-2糖蛋白gB mRNA的表達。結果 PSP作用組HSV-2糖蛋白gB mRNA的表達顯著低于陽性對照組(P0.01)。結論 PSP抗HSV-2作用的機制之一為抑制

2、HSV-2糖蛋白gB基因的轉錄。【關鍵詞】螺旋藻多糖；單純皰疹病毒2型；原位雜交Inhibition of HSV-2 glycoprotein gB mRNA expression by polysaccharide from spirulina platensis(PSP)【Abstract】 Objective To explore the effects and mechanism of PSP on the expression of HSV-2 gB mRNA and to provide a theoretical support for developing new drugs

3、.Methods PSP was applied at various concentrations to Vero cells infected by HSV-2， In situ hybrization was adopted to explore the expression of HSV-2 gB mRNA with digoxigenin(DIG)-labeled HSV-2 oligoprobe. Results HSV-2 gB mRNA were less expressed in PSP treated group than that in the control (P0.0

4、1).Conclusion One of the mechanism of PSP against HSV-2 may be explained by the considerable inhibition of HSV-2 （螺旋藻多糖對HSV-2糖蛋白gB mRNA表達的抑制作用 gB gene trscription.【Key words】 polysaccharide from spirulina platensis; HSV-2; in situ hybrization單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus-2， HSV-2)在人群中感染較為普遍。孕婦生殖器感染可

5、引起早產、流產、死胎、胎兒畸形以及智力低下等，并與子宮頸癌的發(fā)生密切相關1，2。近幾年研究表明：鈍頂螺旋藻多糖（polysaccharides from Spirulina platensis，PSP）是鈍頂螺旋藻中具有抗腫瘤、抗輻射、抗病毒和免疫調節(jié)作用的重要生物活性物質3，4。我們的前期實驗結果表明，PSP有抗HSV-1的作用，但PSP抗HSV-2的實驗研究未見報道。本文研究了PSP對HSV-2糖蛋白gB mRNA表達的抑制作用，結果報告如下。1 材料與方法 1.1 藥品與試劑配制 螺旋藻多糖：參照文獻5，6，采用改良的三氯乙酸去蛋白法提取螺旋藻多糖，純度達92以上。以雙蒸水配成10mg/

6、ml母液，過濾除菌，分裝，4保存，臨用時以DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。 細胞培養(yǎng)所用的DMEM干粉培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產品，胰酶為Amersco公司產品，新生牛血清為杭州四季青公司產品；地高辛DNA檢測試劑盒為Roche公司產品。1.2 細胞株與病毒 非洲綠猴腎細胞Vero細胞株為本室保存?zhèn)鞔毎怠Ｓ贒MEM基礎培養(yǎng)液中加入10%的新生牛血清，100U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素，置5CO2孵箱中37培養(yǎng)，3天傳代1次。標準單純皰疹病毒2型（HSV-2）333株來源于中國協(xié)和醫(yī)科大學，Vero細胞中傳代，毒種保存于-70。 1.3 病毒滴度的測定 以TCID50表示病毒毒力。取

7、上述制備好的毒株，做10倍系列稀釋，10-1至10-10。將各稀釋度的毒株接種于Vero細胞，各6復孔，同時設陰性對照。37培養(yǎng)3天后，觀察細胞病變，以出現(xiàn)細胞病變的最高稀釋倍數的倒數作為TCID50。1.4 原位雜交檢測HSV-2糖蛋白gB mRNA的表達 探針的設計7，8 根據Gen Bank中HSV-2 全基因序列，設計對應于HSV-2糖蛋白gB基因序列的寡核苷酸探針序列為5-ggcgactttgtgtacatgtccccgttttacggctaccgg -3，由上海生工公司合成，并于5末端標記地高辛。 原位雜交9 Vero細胞制成2×105/ml細胞懸液，接種在放有蓋玻片（飛

8、片）的培養(yǎng)板中，每孔加入1.8ml細胞，于5CO2孵箱中37培養(yǎng)2448h，棄生長液，加約100 TCID50病毒液50l，37吸附2h，吸出病毒液，加200l不同濃度的PSP（100g/ml、50g/ml和10g/ml）， 置5CO2孵箱中37培養(yǎng)。24h后，取出細胞飛片經4%多聚甲醛室溫下固定20min，PBS漂洗2次，梯度乙醇脫水，蛋白酶K（1g/ml）37消化30min，PBS漂洗2次，2×SSC洗2次，梯度乙醇脫水，空氣干燥。每張飛片滴加50l 雜交液，預雜交2h；加入含探針的雜交液，置于密閉濕盒中，60過夜。雜交結束后，飛片在室溫下依次經2×SSC、1×

9、;SSC、0.5×SSC漂洗各2次，于Buffer洗液中10min，封閉液Buffer中37孵育30min，加入抗體液37孵育3060min，Buffer洗液中10min，置Buffer平衡10min，新鮮配制的顯色液中避光孵育10min至數小時，終止提 （，。）反應。中性樹膠封片。實驗同時設3個陰性對照：(1) 雜交前用Rnase A 100g/ml預處理細胞飛片，37，1h；(2) 加未標記的探針進行反應；(3) 正常的Vero細胞。陽性對照為未加PSP作用的HSV-2感染Vero細胞組。所有操作步驟與其他樣本相同。結果判定：400×光鏡下隨機選擇視野，觀察200個細胞

10、，計數雜交陽性的細胞數。陽性信號呈明亮的藍紫色。1.5 統(tǒng)計學方法 核酸雜交結果以(x±s)表示，多組數據比較采用方差分析。2 結果光鏡下觀察原位雜交結果，可見表達HSV-2糖蛋白gB基因的Vero細胞被染成藍紫色，染色部位位于細胞漿，而正常Vero細胞未見陽性信號表達（圖1）。不同劑量PSP作用的HSV-2感染組，其糖蛋白gB mRNA的表達顯著低于陽性對照組（P0.01），10g/ml、50g/ml、100g/ml PSP可使gB mRNA的表達由86.61%分別降至62.29%、46.12%和31.56%（表1）。 1 聞玉梅. 現(xiàn)代醫(yī)學微生物學.上海: 上海醫(yī)科大學出版? （

11、螺旋藻多糖對HSV-2糖蛋白gB mRNA表達的抑制作用(3) 紓?1999，1227-1244.2 Whitely RJ， Roizman B. Herpes simplex virus infections. Lancet，2001， 357:1513-1518.3 涂芳， 楊芳， 鄭文杰，等. 螺旋藻多糖的研究進展. 天然產物研究與開發(fā)， 2005， 17（1）: 115-119. 4 于紅，張學成. 螺旋藻多糖抗HSV-1作用的體外實驗研究. 高技術通訊，2002，12(9):65-69. 5 Lee JB， Hayashi T， Hayashi K， et al. Further p

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