1、茶多酚干預乳腺癌組織及重要器官血管生成相關因子表達研究    摘要：目的 觀察茶多酚對移植性小鼠乳腺癌（EMT6）組織與重要臟器（心、腦、腎）組織血管生成相關因子表達影響。方法 應用小鼠可移植性乳腺癌EMT6 細胞株，經培養傳代后，以純系BALB/c 小鼠為荷瘤動物進行移植，并采用茶多酚灌胃及局部注射兩種干預措施，以免疫組化方法檢測小鼠乳腺癌組織VEGF、bFGF、TIMP-2 表達，并測定心、腦、腎組織中VEGF及TIMP-2 表達。結果 與模型對照組比較，茶多酚兩種給藥途徑的腫瘤組織VEGF、bFGF 陽性表達明顯降低（P<0.05）；TIMP

2、-2 陽性表達明顯增高（P<0.05）；而心、腦、腎組織VEGF、TIMP-2 陽性表達無明顯差異（P>0.05）。 結論 茶多酚可明顯抑制新生血管生成相關因子表達，并特異性的作用于腫瘤靶點部位，預示在腫瘤治療領域具有廣泛的應用前景。關鍵詞：茶多酚；小鼠乳腺癌；VEGF；bFGF；TIMP-2；重要臟器（心、腦、腎）既往實驗研究表明，茶多酚灌胃、腹腔與局部注射三種給藥途徑均能顯著抑制S180 小鼠腫瘤生長1，并認為降低腫瘤組織微血管密度（MDV）2、下調腫瘤組織血管內皮生長因子（VEGF）陽性表達與上調金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-2）陽性表達是其抗腫瘤機制之一3。我們在證實茶

3、多酚能夠抑制小鼠乳腺癌（EMT6）生長4，并結合茶多酚干預后對EMT6 小鼠重要臟器微血管密度（MVD)研究結果，進一步檢測了茶多酚干預后的EMT6 小鼠腫瘤組織及其心、腦、腎組織血管生成相關因子表達，用以初步判定茶多酚抗新生血管形成的特異性與在腫瘤治療中的應用前景。1 材 料1.1 動物與細胞系：雌性BALB/c 小鼠60 只，體重(20±2)g，購自上海斯克萊實驗動物有限公司許可證號：SCXK(滬)2003-0003，并在南京中醫藥大學動物中心屏障系統SPF 環境下飼養。EMT6 小鼠乳腺癌細胞購自中國人民解放軍第四軍醫大學實驗動物中心。1.2 藥物：茶多酚購自浙江東方茶業有限公

4、司，純度98（批號：20050334）；人參皂苷Rg3（參一膠囊）每粒含人參皂苷Rg3 10 mg，購自吉林亞泰有限公司（批號：20040704）。1.3 儀器：超凈工作臺系蘇州安泰空氣技術有限公司生產（型號sa-cj-zFD）；離心機由上海安亭科學儀器廠生產（型號KA-1000）；萊卡倒置顯微鏡為德國萊卡公司產品（型號 DMIL）；Forma 恒溫培養箱為美國Forma 公司產品（型號3111）。1.4 試劑：美國GeneTech 公司生產的VEGF Ab（C-1)，批號：GT 300229；TIMP-2 Ab-2，（批號：IM56T）以及堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）Ab-FGF2（批

5、號：BA0259）均購自博士德生物工程有限公司；免疫組化超敏鼠組織試劑盒（UltraSensitiveTMS-P）購自福州邁新生物技術開發有限公司。2 方 法2.1 細胞培養與接種：EMT6 細胞用含10 小牛血清的RMPI1640 培養液培養，細胞長滿單層后用0.25胰酶消化，培養液吹打離心，收集細胞用PBS 稀釋，濃度調至5×106，每只小鼠以0.2 ml 接種于小鼠右后背部。12 天后腫瘤長至1g 時移植。2.2 腫瘤移植：斷頸處死荷瘤小鼠，75酒精浸泡35min 后放于超凈工作臺平皿中，用高壓滅菌的手術器械剪開腫瘤皮膚，分離腫瘤包膜，取出腫瘤以消毒后的PBS 清洗，稱重，按每

6、克腫瘤4ml 溶液的比例用生理鹽水稀釋。剪碎瘤體，充分勻漿制成細胞懸液，濃度調至2×106，每只小鼠于右后背部皮下接種0.2ml。2.3 分組及用藥：接種第13 天腫瘤長至1mm3 時（成瘤48 只），隨機分為4 組，即茶多酚灌胃組、茶多酚局部注射組、人參皂苷Rg3 灌胃組，模型對照組。每組12 只動物。所有給藥劑量均采用人與動物劑量換算法確定。即：茶多酚灌胃組：按人治療量900mg/d 計算，換算成實驗用藥中劑量為11.25mg/kg，并按小鼠體重20g 計算，以2.25mg/d 配置濃度5.625mg/ml，每天灌胃0.4ml。茶多酚局部注射組：參考茶多酚腹腔注射LD50 160

7、mg/kg劑量，取其1/4 量為實驗用小劑量組，換算成實驗用藥中劑量為12mg/kg，以2.4mg/d 配制濃度24mg/ml，每天局部注射0.1ml。人參皂苷Rg3 組：按人治療腫瘤劑量40mg/d 計算，換算成20g 小鼠劑量為0.1mg/d，配制濃度為0.25mg/ml，每天灌胃0.4ml。模型對照組：生理鹽水灌胃，每天0.4ml。在接種第13 天開始給藥、給水，每日1 次，連續給藥10 天。第11 天處死小鼠，取腫瘤及心、腦、腎組織制備切片待撿。2.4 血管因子檢測：將腫瘤組織及心、腦、腎組織取出后迅速放置于10%福爾馬林溶液中固定，第二天脫水，石蠟包埋，連續切片為4um 厚，其中取一

8、張做HE 染色，其余每組選取3個組織切片，按相關試劑盒說明檢測VEGF、bEGF 與TIMP-2 表達。用PBS 作為一抗做陰性對照。染色陽性者為棕黃色，部位在內皮細胞胞漿。各組選取腫瘤組織及心、腦、腎組織各3個組織切片，每片選3 個視野，用美國TN-8502 圖像分析系統作圖像分析，測定光密度（IOD）值，取其平均值，以均數±標準差（x ± s）表示。2.5 統計方法：實驗數據用SPSS11.5 計算機統計軟件進行t 檢驗，當P<0.05 時表示差異有顯著性，當P>0.05 時表示無統計意義。3 結 果3.1 腫瘤組織血管相關因子測定：EMT6小鼠腫瘤組織VE

9、GF、bFGF、TIMP-2 測定結果見表1；組化染色圖片見圖112。從表1 可以看出，與模型組比較，茶多酚灌胃、局部注射以及Rg3 干預后腫瘤組織的VEGF、bFGF 表達明顯減少，而TIMP-2 明顯升高，均有統計學意義（P<0.05）。說明抑制腫瘤組織VEGF、bFGF 表達，增加TIMP-2 表達是茶多酚抑制EMT6 生長機制之一。3.2 重要臟器血管相關因子測定：EMT6 小鼠心、腦、腎組織VEGF、TIMP-2 測定結果見表2；組化染色圖片見圖1324。4 討 論腫瘤生長和轉移與瘤區血管豐富程度有密切的關系。腫瘤新生血管為腫瘤細胞生長輸送營養并排泄代謝產物，轉移灶形成也依賴于

10、新生血管生成。基礎實驗證明，腫瘤體積超過2mm3 時，都有新生血管生成。因而有效抑制血管新生，切斷腫瘤血供，有望達到抑制腫瘤生及轉移效果5-6。故抗腫瘤新生血管生成研究已成為腫瘤臨床治療領域的熱點問題。目前認為，腫瘤血管生成過程可分血管內皮細胞增值、血管基底膜破壞、血管內皮細胞游走與構成血管樣結構四個主要步這驟，其中也包含腫瘤細胞與正常細胞相互作用的細胞外基質、相關細胞參與以及大量細胞因子調節程度等生理、病理變化過程7。而抗腫瘤血管生成主要策略是針對腫瘤血管調控因子及其作用環節進行干預。抗腫瘤血管生成藥物也直接或間接在于血管相關因子。血管內皮生長因子（VEGF）是一種高度特異的血管內皮細胞有絲

11、分裂素，能選擇性增強血管內皮細胞有絲分裂，刺激內皮細胞增殖，促進血管生成，并能提高血管尤其是微小血管的滲透性，使血漿大分子外滲沉積在血管外基質中，從而為腫瘤細胞生長和新生毛細胞血管網的建立提供了營養條件。因此，VEGF是抗腫瘤血管生成藥物作用的重要靶點部位8。已研制的VEGF及VEGFR單克隆抗體主要用以封閉已分泌的VEGF及VEGFR，可以阻止VEGF誘發內皮信號轉導系統。如針對VEGFR的酪氨酸激酶抑制劑鈥淪U5416鈥澮呀孝罅俅彩匝椋徽攵訴EGF的單克隆抗體鈥淎dvastin鈥澮咽雜糜謚琢雋俅倉瘟疲昧艘歡牧俅擦菩9。但因價格昂貴與有嚴重毒副反應未能在我國廣泛推廣應用。在血管生成網絡調控中

12、，堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）起著關鍵作用。bFGF 能促進表皮、內皮細胞再生、血管內皮細胞分裂，并從基膜中分離出來以刺激內皮細胞向腫瘤組織趨化運動，并形成管狀結構；同時，還能提高組織中血纖維蛋白溶解酶原激活因子以及能誘導內皮細胞產生其他蛋白酶，從而促進毛細血管形成10。基質金屬蛋白酶(MMPs)在降解血管基底膜和內皮細胞的胞外基質，破壞血管結構，使內皮細胞從血管壁上脫落以形成新生血管這一關鍵環節中發揮作用11。MMPs 抑制劑能夠通過抑制MMPs 的蛋白水解活性，能夠有效的抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤轉移。按照功效分類，MMP 抑制劑有人工合成和天然存在的兩種形式。其中，組織金屬蛋白酶抑制

13、劑(TIMP)為天然存在的金屬蛋白酶抑制劑，所有的TIMP 家族成員不僅能抑制血管生成，還可以直接遏止腫瘤細胞和內皮細胞增殖和遷移，從而抑制腫瘤生長；人工合成的腫瘤血管活性藥物如batimastat(BB94)、marimastat(BB2516)等也已試用臨床試驗12。但實際療效有待進一步評價。茶多酚是從綠茶中提取的多酚類活性物質，其不僅具有預防心腦血管疾病、抗衰老等功能效應，近些年的基礎研究發現，茶多酚還具有防治腫瘤效應。對其作用機制認為與茶多酚直接殺傷腫瘤細胞、誘導細胞凋亡與誘導細胞分化、抗突變、抗轉移等有密切關系13-14。我們在國內首次研究發現，茶多酚能夠抑制腫瘤新生血管生成2-3。但其是否在抑制腫瘤新生血管的同時，對正常組織器官微血管具有抑制效應國內外尚未見到文獻報道。為解決這一關鍵科學問題，在該課題研究中，除選擇了茶多酚干預治療后EMT6 腫瘤組織的VEG