1、生物傳感與DNA陣列生物傳感器（biosensors）是生物分析化學的一個重要領域，它結合了生命科學、分析化學、物理學和信息科學及其相關技術，能夠對所需要檢測的物質進行快速分析和追蹤。生物傳感器的基本原理生物傳感器結構與原理待分析物生物功能膜分子識別引起的物理或化學量的變化換能器可測電信號圖8.1 生物傳感器的原理生物功能膜，又稱生物敏感膜（biosensitive membrane）或分子識別元件（molecular recognition element），是生物傳感器的核心器件，直接影響傳感器的功能和質量。換能器的作用是將生物學反應過程中產(chǎn)生的各種信息轉變成可方便測量的電信號。生物學反應

2、的信息是多元化的，包括各種生物、化學和物理信息，現(xiàn)代電子學、微電子學及傳感技術的成果為檢測這些信息提供了豐富的手段，為生物傳感器的設計提供了足夠的方法。表8.1 生物傳感器的分子識別元件分子識別元件(生物敏感膜)生物活性材料分子識別元件(生物敏感膜)生物活性材料酶全細胞組織細胞器各種酶類細菌、真菌、動物與植物細胞動物、植物的組織切片線粒體，葉綠體免疫物質生物親和物質核酸模擬酶抗體,抗原,酶標抗原等配體，受體寡聚核苷酸高分子聚合物表8.2 生物學反應信息與換能器生物學反應信息換能器選擇生物學反應信息換能器選擇離子變化電荷變化電阻變化、電導變化質子變化氣體分壓變化熱焓變化離子選擇性電極電容檢測阻抗

3、計，電導儀場效應晶體管氣敏電極熱敏電阻，熱電偶光學變化界面電容改變顏色變化(光學范疇)質量變化力變化振動頻率變化光纖，光敏管，熒光計交流阻抗分析儀等光纖，光敏管壓電晶體等微懸臂梁表面等離子體共振生物功能物質與分子識別生物傳感器的分子識別器件，主要是指來源于生物體的生物活性物質，包括酶、抗原與抗體和各種功能蛋白質、抗體酶、核酸、催化性核酸、激素、微生物細胞、細胞器、動植物組織等，當它們被用作生物傳感器的分子識別器件時，具有對靶分子（待檢測對象）特異的識別功能。分子識別往往是生物體進行各種簡單反應或復雜反應的前奏。分子識別能力決定生物傳感器的選擇性和靈敏度。因此，了解和掌握生物功能物質的性質及進行

4、分子識別的特征，如酶促反應、免疫反應、核酸與核酸反應（雜交，hybridization）、離子在膜中選擇性傳輸和生物與藥物、生物分子間弱相互作用等，對研究和開發(fā)生物傳感器具有重要的指導意義。生物學反應中的物理量的變化生物反應常常伴隨一系列的物理量變化，如熱焓、光、顏色、阻抗等，利用這些物理量變化能夠設計一些精巧的傳感裝置。生物反應的熱力學任何生物學反應過程都伴隨著熱力學變化，如分子異構、分子間相互作用、生物催化反應等都會引起系統(tǒng)內(nèi)部或外部的熱變化。生物分子三維結構的改變會引起其功能變化，利用微量測熱法測量分子結構轉變過程或前后的熱信息可以確定蛋白質結構的穩(wěn)定性。生物發(fā)光生物發(fā)光(biolumi

5、nescence)是指生物體內(nèi)某些特殊物質的氧化而產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象。生物發(fā)光大多由熒光素酶(1uciferase)催化，如螢火蟲的ATP依賴性發(fā)光反應等。E + ATP + LH2 E-LH2-AMP +PP E-LH2-AMP + O2 E-L-AMP + H2O +h2 顯色反應生物反應過程中的顏色變化包括生物體內(nèi)產(chǎn)生色素和生物體或酶與底物作用后生成有色物質兩個方面。各種色素是由不同的生物合成途徑產(chǎn)生的，每一種途徑都包含若干生物化學反應，每一種反應都是由特殊的酶催化的。生物功能膜的制備生物膜的模型從層數(shù)上來分可分為單層膜、雙層膜和多層膜。單層膜主要是指Langmuir-Blodgett(L-

6、B)膜；脂雙層膜又包括平板雙層膜(planar bilayer)和脂質體(1iposome)，平板雙層膜又可分為非支撐平板雙層膜(又稱黑膜，BLM)和支撐平板雙層膜(s-BLM)；多層膜主要指磷脂鑄膜(cast lipid film)。Langmuir-Blodgett(L-B)膜技術脂雙層膜多層磷脂膜固定化生物功能膜電子傳遞媒介體生物傳感器電子傳遞媒介體大致有兩類:生物體內(nèi)的天然介體。如細胞色素類(氧化型/還原型，red/ox)、輔酶NAD(P)/NAD(P)H、鐵硫蛋白III/鐵硫蛋白II等。底物分子脫下的氫，經(jīng)一系列中間傳遞體到達分子氧。每對中間傳遞體都能往復地接受氫或電子，以促進全部生

7、物氧化過程的完成。非生物源介體，包括一些酸堿指示劑、有機染料、金屬絡合物等。循環(huán)伏安法循環(huán)伏安法通常采用三電極實驗系統(tǒng)即工作電極(working electrode)、對電極(counting electrode)和參比電極(reference electrode)。工作電極可以用金、鉑或碳電極等；對電極一般用鉑網(wǎng)；參比電極為飽和甘汞電極或銀/氯化銀電極。電極在使用前須清洗，工作電極用氧化鋁粉拋光，對電極用1 mol L-1硫酸在-0.1+1.1 V之間反復清洗，直至其循環(huán)伏安圖譜達恒定值，然后再用去離子水洗滌，伏安圖譜用電化學分析儀分析記錄。(a) (b)圖8.3 循環(huán)伏安法(a) 電位與時

8、間的關系，線性掃描電位掃至某電位值Em后，再回掃至原來的起始電位值Ei;(b) 典型的循環(huán)伏安圖(CV), 轉換點為回掃的開始電子傳遞媒介體生物傳感器圖8.4 電子傳遞媒介體傳感器的反應過程無試劑生物傳感器圖8.5 三代電化學生物傳感器的響應機理蛋白質在電極上的直接電化學蛋白質在金膠納米粒子修飾電極上的固定與直接電子傳遞圖8.6 膠體金納米粒子單層的組裝和蛋白質在ITO電極上的固定.納米粒子在無試劑生物傳感器制備中的應用生物傳感器的應用生物傳感器的臨床診斷血糖測定乳酸測定尿素及尿酸測定谷氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)測定免疫傳感器一、免疫傳感器制備二、電化學免疫傳感器三、質量檢測免疫傳感器四、熱量

9、檢測免疫傳感器五、光學免疫傳感器六、免疫傳感器的發(fā)展生物傳感器在發(fā)酵與食品工業(yè)中的應用氨基酸類酒精測定維生素c與淀粉測定過氧化氫測定 果糖測定DNA陣列DNA陣列的原理DNA微陣列(DNA microarray)是生物芯片技術之一。它將無數(shù)預先設計好的寡核苷酸、cDNA或基因組DNA有序地高密度固定排列在載體上(玻璃、硅、塑料等硬質載體)制成點陣，通過與樣品中同源核酸進行分子雜交，一次性檢測和分析樣品中的大量序列。cDNA微陣列與寡核苷酸微陣列并稱為核酸微陣列(nucleic acid microarray)。與寡核苷酸微陣列一樣，cDNA微陣列也是利用Watson-Crick堿基配對原理，通

10、過分子雜交的化學過程產(chǎn)生微陣列信號，兩者所包含的微陣列均以DNA或RNA作為探針分子。cDNA微陣列中的cDNA探針長度一般為0.52.5 kb，用這樣的分子制備的微陣列可產(chǎn)生很強的雜交信號。cDNA微陣列可以通過與靶分子雜交平行分析大量基因的mRNA表達譜，根據(jù)每個cDNA位置的熒光強度，可以定量測定對應的mRNA水平。DNA陣列的制備方法主要有光引導原位合成法(light-directed synthesis)、壓電打印原位合成法(piezoelectric printing in situ synthesis)、合成后交聯(lián)法(off-chip DNA synthesis attachme

11、nt)和微點樣技術。1. 光引導原位合成法第一步，將載體表面氨基化或羥基化。第二步，在羥基上加光敏保護基團，用光敏保護基團將載體表面的氨基保護起來。第三步，當光線(如紫外線)通過罩在載體上的光刻掩蔽物(mask)時，有光線通過的部分，光敏保護基團脫去，氨基被活化并與加入的一端連有光敏保護基團的脫氧核苷酸反應，使該單體分子連接到載體表面的氨基上。2. 微點樣技術制備DNA陣列微點樣技術（micro spotting）是利用手工或自動點樣裝置將預先制備好的寡核苷酸和cDNA樣品按一定排列規(guī)律點在經(jīng)過特殊處理的玻璃片或其它基片上，利用載體表面的活性基團與核苷酸分子作用形成共價或非共價結合，除去多余寡

12、核苷酸分子并封閉多余活性基因，即制成DNA微陣列。DNA陣列的應用DNA芯片不僅可以用于基因表達分析，揭示基因是否表達、上調或下調，了解完整的基因轉錄和調控過程，還可從上千個樣品中的數(shù)以萬計的基因座中探查等位基因的異同，提供由于基因異常引起的疾病的信息，也可用于生物基因型分類和基因多態(tài)性、細胞因子、黏附分子、受體、離子通道、信號轉導、生物大分子化學、細胞周期、應激反應、翻譯調控、細胞凋亡、腫瘤鑒定，在疾病和腫瘤診斷、藥物靶標篩選、藥物評價等方面有重要的用途。圖8.19 DNA陣列用于基因表達譜分析流程一、比較基因組研究分析基因組時，檢測和確定復雜DNA樣品中各種不同序列的相對豐度是非常困難的。

13、利用熒光標記的DNA微陣列方法，可解決這個難題。將864個酵母基因組DNA的l克隆(占酵母基因組的75以上)排列在1.8 cm´ 1.8 cm的玻璃基片上，總共含有1744個點陣單元。在這種微陣列中，標記不同熒光團的兩套不同的分離酵母染色體可同時發(fā)生雜交。用激光熒光掃描儀檢測來自兩種熒光團的雜交信號，可分析復雜的DNA樣品。該系統(tǒng)在全基因組的遺傳作圖、物理作圖和基因表達研究等方面有著廣泛用途。基因芯片可用于由于基因修飾而影響基因表達改變的研究，如腫瘤細胞中DNA 的異常甲基化可以導致一些癌基因及轉移相關基因表達的改變。Melanie等使用4000個基因的芯片GF211研究去甲基化處理

14、前后的高轉移性乳腺癌細胞系的基因表達譜證實了DNA異常甲基化是導致nm23-H1表達下調的原因之一。二、腫瘤研究中的應用人黑色素瘤細胞系UACC-903的致瘤特性可以通過導入正常的6號染色體而得到抑制。DeRisi等171構建了含1161個cDNA探針的高密度微陣列，研究了引入6號染色體的黑色素瘤細胞系中與腫瘤抑制相關的基因的表達差異。用于雜交的熒光探針來源于兩種細胞mRNAUACC-903和UACC-903(+6)，并標記了不同的熒光素。分析與陣列上每個基因雜交的熒光信號，可確定每個基因對應的兩種mRNA樣品中的相對豐度。那些以前未發(fā)現(xiàn)的特定基因表達的改變則提供了進一步研究這些細胞致瘤表型遺

15、傳基礎的線索。Khan等用含有1238個cDNA的微陣列研究了一組共7個泡狀橫紋肌肉瘤(ARMS)細胞系的基因表達譜。采用多維測度法(multidimensional scaling)描述該細胞系在二維歐氏空間里的相互關系，確定了ARMS細胞表現(xiàn)一致的表達譜，從而將這些細胞進行聚類。通過檢查這些細胞系，發(fā)現(xiàn)這1238個基因中有37個基因在ARMS細胞中表達非常恒定，其中只有3種基因以前報道過在ARMS表達。這37種基因中，有的與ARMS中原發(fā)性(PAX3-FKHR)和繼發(fā)性(CDK4)遺傳改變均相關。Heiskanen等將cDNA微陣列技術、比較基因組雜交(CGH)技術和組織微陣列技術結合起來

16、，檢測到成纖維細胞生長因子受體2基因(FGFR2)在乳腺癌中的低頻擴增。乳腺癌細胞系SUM-52中存在幾個高水平DNA擴增位點，包括FGFR2所在的染色體區(qū)域10q26。首先利用CGH技術檢測基于細菌人工染色體克隆的微陣列，發(fā)現(xiàn)FGFR2在SUM-52細胞中有高水平擴增，然后用含588個基因的cDNA微陣列檢測到FGFR2在SUM-52細胞中過度表達(超過40倍)，最后用熒光原位雜交(FISH)檢測了750例原發(fā)性乳腺癌標本的組織芯片，結果顯示FGFP2只在1原發(fā)性乳腺癌患者體內(nèi)擴增。三、在其它疾病研究中的應用HeIler等用cDNA微陣列技術分析兩種炎性疾病(類風濕性關節(jié)炎和炎癥性腸病)的基

17、因表達情況，cDNA微陣列是用挑選的可能對炎癥具有意義的基因以及表達于外周血單個核細胞的基因制備的。培養(yǎng)的巨噬細胞、軟骨細胞系、原代軟骨細胞和滑膜細胞的mRNA水平提供了細胞因子、趨化因子、DNA結合蛋白和降解基質的金屬蛋白酶的表達譜。通過微陣列技術對這兩種疾病組織樣品進行比較，發(fā)現(xiàn)了涉及其中的許多基因，同時還發(fā)現(xiàn)白介素3(IL-3)、趨化因子Gro a和金屬蛋白酶基質金屬彈性蛋白酶等因子也參與了這兩種疾病。通過對外周血文庫鑒定發(fā)現(xiàn)，類風濕性關節(jié)炎與炎癥性腸病相比，金屬蛋白酶組織抑制劑、鐵蛋白輕鏈和鎂超氧化物歧化酶基因的表達有差異。四、在細菌學研究中的應用Ichikawa等用從銅綠假單胞桿菌感染的型肺細胞系A549中提取的RNA制備熒光標記探針，用高密度DNA微陣列(由1506個人cDNA克隆組成)監(jiān)測了感染的A549細胞中的基因表達，從中鑒定出細菌感染后差異表達的基因。陳永青等利用含有12800個