1、地菇菌栽培技術(shù)一、 食用菌（微生物）的培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵消毒滅菌。消毒滅菌:可切斷傳播途徑、控制感染擴(kuò)散造成的危害；也可殺滅物品或器皿上的細(xì)菌，防止感染；是保證不受外來(lái)微生物污染的前提。 1常用術(shù)語(yǔ)：（1）滅菌 是破壞和去除物體上所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）和細(xì)菌芽胞的方法。如外科器械、注射器、基礎(chǔ)培養(yǎng)基滅菌等。 （2）消毒 是破壞物體上活的病原微生物的方法，但不包括細(xì)菌芽胞和非病原微生物。如用酒精溶液浸泡體溫計(jì)、潔而滅液擦拭檢查臺(tái)等。用于消毒的化學(xué)物品稱(chēng)消毒劑(disinfectant)。一般而言,消毒對(duì)象是指物體而不是機(jī)體。 （3）防腐 直接使用防腐劑(antiseptics)破

2、壞或抑制活病原微生物方法。如實(shí)驗(yàn)前碘液或酒精擦洗皮膚、雙氧水清創(chuàng)傷口或殺菌肥皂清洗雙手等應(yīng)當(dāng)使用該術(shù)語(yǔ)。 （4）無(wú)菌 防止感染病原體進(jìn)入滅菌組織或物品的操作技術(shù)稱(chēng)無(wú)菌操作，無(wú)菌即為不存在活微生物。 2物理消毒滅菌法 （1）熱力消毒滅菌法 利用高熱使蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)加快，肽鏈連接鍵斷裂，蛋白變性凝固，細(xì)胞膜功能受損致胞內(nèi)物質(zhì)漏出，細(xì)菌內(nèi)外環(huán)境平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致微生物死亡。不同種類(lèi)微生物對(duì)熱的耐受力不同，有芽胞細(xì)菌對(duì)高溫有強(qiáng)的抵抗力。熱力滅菌分干熱滅菌法和濕熱滅菌法兩大類(lèi)，相同溫度下，濕熱環(huán)境中菌體蛋白易凝固，穿透力比干熱大，其蒸氣變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可釋放潛熱，迅速提高被滅菌物體的溫度。1）干熱滅菌法 包括

3、：焚燒：直接點(diǎn)燃或在焚燒爐內(nèi)進(jìn)行，僅適用于廢棄物品或動(dòng)物尸體。燒灼：直接以火焰滅菌，適用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室接種環(huán)、針和試管口等滅菌。干烤 在干烤箱內(nèi)進(jìn)行，加熱至15018024h達(dá)到滅菌效果，適用于高溫下不變質(zhì)、不被破壞和不蒸發(fā)的物品，如玻璃器皿、瓷器，不能用于塑料、棉、紙制品。 2）濕熱滅菌法 包括：巴氏消毒法：是用較低溫度殺滅液體中的病原微生物或特定微生物而保持物品中所需的不耐熱成分的方法。大多采用71.6加熱15秒，用于牛乳消毒。煮沸法：在一個(gè)大氣壓下，煮沸后的水溫度達(dá)100，煮沸5min后可殺死一般細(xì)菌繁殖體。流通蒸氣消毒法：又稱(chēng)常壓蒸氣消毒法，常用阿諾(Arnold)流通蒸氣滅菌器或蒸

4、籠，利用1個(gè)大氣壓下100水蒸氣進(jìn)行消毒，1030min后細(xì)菌繁殖體被殺死，但對(duì)芽胞作用不大。間歇滅菌法：采用間歇方式達(dá)到滅菌目的。將滅菌物品置于阿諾流通蒸氣滅菌器內(nèi)，100加熱1530min，每日一次，連續(xù)三次。每次滅菌后取出物品置37孵育箱過(guò)夜，致殘存的芽胞發(fā)育成繁殖體，次日再通過(guò)流通蒸氣滅菌器加熱而被殺滅。如此反復(fù)以達(dá)到殺滅芽胞又使不耐高溫的物質(zhì)免受影響。常用血清凝固器對(duì)呂氏血清培養(yǎng)基和魯琴培養(yǎng)基的滅菌屬此方法。高壓蒸氣滅菌法 利用密閉的耐高壓蒸氣滅菌器(autoclave),在蒸氣不外溢的條件下，使鍋內(nèi)壓力增高，隨之蒸氣溫度也增高。通常在103.4kpa壓力下蒸氣溫度達(dá)到121.3,

5、維持1520min可殺滅所有的繁殖體和芽胞。本法適用于耐高溫、耐濕物品的滅菌，如普通培養(yǎng)基、生理鹽水、手術(shù)敷料等。 （2）輻射法 1）電離輻射 能產(chǎn)生電離輻射效應(yīng)的有X射線、射線、陰極射線。受照射后，敏感的靶物質(zhì)如細(xì)菌DNA吸收了射線產(chǎn)生能量，產(chǎn)生較大范圍的突變，或產(chǎn)生毒性物質(zhì)如自由基可破壞微生物核酸產(chǎn)生致死作用。電離輻射由于滅菌時(shí)不產(chǎn)生熱量又稱(chēng)“冷滅菌法”，適用于對(duì)熱敏感的物品及化學(xué)物質(zhì)的滅菌,如一次性醫(yī)用塑料制品和移植組織（骨、皮膚、心瓣膜等）和食品滅菌。 2）非電離輻射 紫外線 殺菌紫外線波長(zhǎng)為240280nm，它作用于DNA鏈上相鄰兩個(gè)胸腺嘧啶或胞嘧啶，共價(jià)結(jié)合形成二聚體而干擾DNA復(fù)

6、制與轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。紫外線穿透力弱，故常用于空氣消毒和不耐熱物品表面消毒。 微波 是波長(zhǎng)為1103 nm的電磁波，可穿透玻璃、陶瓷、塑料薄膜等物質(zhì)，常用于檢驗(yàn)室用品、食品食具、藥杯及其他用品的消毒。 （3）聲波 超聲波的空化作用破壞了細(xì)菌原生質(zhì)膠體狀態(tài)導(dǎo)致細(xì)菌裂解。革蘭陰性菌對(duì)其敏感。主要用于細(xì)菌細(xì)胞粉碎以提取細(xì)胞的組分或制備抗原。 （4）濾過(guò)除菌法 以物理阻留的方式將液體或空氣中的微生物除去以達(dá)到無(wú)菌目的。用于不耐高溫物品如血清、抗毒素、抗生素等的滅菌，超靜工作臺(tái)和層流室空氣也用濾過(guò)法除菌。 3化學(xué)消毒滅菌法 化學(xué)藥物使菌體蛋白變性沉淀、干擾微生物酶系統(tǒng)影響其代謝和損傷細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致

7、菌體內(nèi)容物漏出，而發(fā)揮防腐、消毒和滅菌作用。只能外用或用于環(huán)境物品的消毒。 （1）化學(xué)消毒劑的種類(lèi)： 1）根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)不同分類(lèi) 可以分成酶類(lèi)、醇類(lèi)、重金屬鹽類(lèi)、氧化劑、表面活性劑、烷化劑、染料、酸堿類(lèi)等。 2）根據(jù)殺滅微生物作用強(qiáng)弱分類(lèi)： 高效消毒劑 可殺滅一切微生物。如戊二醛、甲醛、環(huán)氧乙烷、過(guò)氧乙酸等。 中效消毒劑 殺滅除芽胞以外的微生物。如乙醇、碘伏等。 低效消毒劑 不能殺滅芽胞、結(jié)核分枝桿菌。如氯己定、苯扎溴銨等。 （2）影響消毒劑效能的因素 通常消毒劑的濃度和作用時(shí)間與消毒劑殺滅微生物的效能成正相關(guān)，但也有例外，如乙醇，其濃度為7075%時(shí)殺菌力最強(qiáng)。影響消毒劑作用的因素有消毒

8、劑的性質(zhì)、濃度和作用時(shí)間；微生物的種類(lèi)與數(shù)量；溫度與濕度；酸堿度；環(huán)境中有機(jī)物存在的拮抗；其他化學(xué)拮抗物質(zhì)。 （3）常用化學(xué)消毒劑的應(yīng)用 鹵素化合物 是有效的殺菌和滅菌劑，用于水、食品、設(shè)施消毒。如碘伏常用作于皮膚的除菌。 酚類(lèi)化合物 是強(qiáng)效殺菌劑，通常用于物品消毒。 醇類(lèi) 一般起抑菌作用。 過(guò)氧化氫 用于傷口防腐和器具消毒。高濃度的過(guò)氧化氫有殺滅芽胞性能。 表面活性劑 用于皮膚粘膜除菌和器具消毒。 醛類(lèi) 破壞微生物酶系統(tǒng)，有潛在滅菌作用。 烷化劑 具高效的殺菌性能，是高效殺菌劑。二、 培養(yǎng)基（一）、培養(yǎng)基種類(lèi)：由于各種所需要的營(yíng)養(yǎng)不同，所以培養(yǎng)基的種類(lèi)很多。據(jù)估計(jì)目前約有數(shù)千種不同的培養(yǎng)基，

9、這些培養(yǎng)基可根據(jù)所含成分、物理狀態(tài)、以及不同的使用目的等而分成若干類(lèi)型。 1.按照培養(yǎng)基的成分來(lái)分 培養(yǎng)基按其所含成分，可分為合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基三類(lèi)。 (1)合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基的各種成分完全是已知的各種化學(xué)物質(zhì)。這種培養(yǎng)基的化學(xué)成分清楚，組成成分精確，重復(fù)性強(qiáng)，但價(jià)格較貴，而且微生物在這類(lèi)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較慢。如高氏一號(hào)合成培養(yǎng)基、察氏（Czapek）培養(yǎng)基等。 (2)天然培養(yǎng)基。由天然物質(zhì)制成，如蒸熟的馬鈴薯和普通牛肉湯，前者用于培養(yǎng)霉菌，后者用于培養(yǎng)細(xì)菌。這類(lèi)培養(yǎng)基的化學(xué)成分很不恒定，也難以確定，但配制方便，營(yíng)養(yǎng)豐富，所以常被采用。 (3)半合成培養(yǎng)基。在天然有機(jī)物的基礎(chǔ)

10、上適當(dāng)加入已知成分的無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，或在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加某些天然成分，如培養(yǎng)霉菌用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。這類(lèi)培養(yǎng)基能更有效地滿足微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要。 2.按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分 培養(yǎng)基按其物理狀態(tài)可分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基三類(lèi)。 (1)固體培養(yǎng)基。是在培養(yǎng)基中加入凝固劑，有瓊脂、明膠、硅膠等。固體培養(yǎng)基常用于微生物分離、鑒定、計(jì)數(shù)和菌種保存等方面。 (2)液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基中不加任何凝固劑。這種培養(yǎng)基的成分均勻，微生物能充分接觸和利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)料，適于作生理等研究，由于發(fā)酵率高，操作方便，也常用于發(fā)酵工業(yè)。 (3)半固體培養(yǎng)基。是在液體培養(yǎng)基中加入少量凝固劑而呈半

11、固體狀態(tài)。可用于觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、鑒定菌種和測(cè)定噬菌體的效價(jià)等方面。 3.按照微生物的種類(lèi)分 培養(yǎng)基按微生物的種類(lèi)可分為細(xì)菌培養(yǎng)基、放線菌培養(yǎng)基、酵母菌培養(yǎng)基和霉菌培養(yǎng)基等四類(lèi)。 常用的細(xì)菌培養(yǎng)基有營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；常用的放線菌培養(yǎng)基為高氏1號(hào)培養(yǎng)基；常用的酵母菌培養(yǎng)基有馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基；常用的霉菌培養(yǎng)基有馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）瓊脂培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基等。 4.按照培養(yǎng)基用途分 培養(yǎng)基按其特殊用途可分為加富培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。 (1)加富培養(yǎng)基。是在培養(yǎng)基中加入血、血清、動(dòng)植物組織提取液，用以培養(yǎng)要求比較苛刻的某些微生物。 (2)選擇性培養(yǎng)基。

12、是根據(jù)某一種或某一類(lèi)微生物的特殊營(yíng)養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢怼⒒瘜W(xué)抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來(lái)。 (3)鑒別培養(yǎng)基。是在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使培養(yǎng)后會(huì)發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類(lèi)型的微生物三、培養(yǎng)基的制備過(guò)程：計(jì)算稱(chēng)量溶化滅菌倒平板（記憶）一般培養(yǎng)基的程序主要可分為：配料、 溶化、矯正pH 、澄清過(guò)濾、分裝、滅菌及檢定等8 個(gè)步驟。（一） 配料按培養(yǎng)基處方準(zhǔn)確稱(chēng)取各種成分，先在三角燒瓶中加入少量蒸餾水，再加入各種成 分，以防蛋白胨等粘附于瓶底，然后再以剩余的水沖洗瓶壁。（二） 溶化將各種成分混勻于水中，最好以流通蒸氣溶化半小時(shí)，如在電爐上溶

13、化應(yīng)隨時(shí)攪 拌，如有瓊脂成分時(shí)更應(yīng)注意防止外溢。溶化完畢，補(bǔ)足失去的水分。（三） 矯正pH1pH 測(cè)定取 與標(biāo)準(zhǔn)管同口徑的試管 （通常用華氏試管）3 支，于第1 、3 管各加入欲測(cè)定pH 的的培養(yǎng)基5ml，并于第一管中加入02gL 的酚紅025ml 作為測(cè)定管，混勻；于第2 管加入蒸餾水5ml ，第4 管為pH 標(biāo)準(zhǔn)比色管，分別按圖59 1 插入比色架內(nèi)進(jìn)行比色。2pH 的校正若測(cè)定管過(guò)酸或過(guò)堿可用01molL 氫氧化鈉或01molL 鹽酸溶液矯正，直至顏色 與標(biāo)準(zhǔn)管相同為止，加堿或加酸時(shí)要精確緩慢，每加1 滴后要充分混勻，比色后再加第2 滴 （有時(shí)僅加半滴） 準(zhǔn)確記錄加入的量。3計(jì)算設(shè)5 m

14、l 培養(yǎng)基矯正pH 至74 時(shí)需01molL 氫氧化鈉015ml，現(xiàn)有培養(yǎng)基4990 ml ， 需加氫氧化鈉的量可按下列方法計(jì)算：54990 015XX 015 ×4990/51497 （ml）如將此01molL 的氫氧化鈉改用1molL 的氫氧化鈉時(shí)，則需149ml 即可。（四） 過(guò)濾澄清培養(yǎng)基配制后一般都有沉渣或混濁出現(xiàn)，需過(guò)濾成清晰透明后方可使用，常用的過(guò) 濾方法如下：1液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基必須清晰，以便觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，常用濾紙過(guò)濾，亦可在加熱前加 入用水稀釋的雞蛋白 （1000ml 培養(yǎng)基用1 個(gè)雞蛋白） 在100 加熱后保持60 70 40 60 分鐘，使其不溶性物質(zhì)附

15、于凝固的蛋白上而沉淀，然后再用虹吸法吸出上清液或以 濾紙過(guò)濾。2固體培養(yǎng)基如系瓊脂培養(yǎng)基，于加熱融化后需趁熱以絨布或兩層紗布中夾脫脂棉過(guò)濾；亦可用自然沉淀法，即將瓊脂培養(yǎng)基盛人鋁鍋或廣口搪瓷容器內(nèi)，以高壓 （10343kPa） 蒸汽 融化15 分鐘后，靜置高壓鍋內(nèi)過(guò)夜，次日將瓊脂傾出，用刀將底部沉渣切去，再融化即可收清晰的瓊脂培養(yǎng)基。（五） 分裝1根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同容量的三角燒瓶、試管中。分裝的量不宜超過(guò)容 器的23 以免滅菌時(shí)外溢。2瓊脂斜面分裝量為試管容量的15 ，滅菌后須趁熱放置成斜面，斜面長(zhǎng)約為試管 長(zhǎng)的23 。3半固體培養(yǎng)基分裝量約為試管長(zhǎng)的13 ，滅菌后直立凝固待用。4高層

16、瓊脂分裝量約為試管的13 ，滅菌后趁熱直立，待冷后凝固待用。5液體培養(yǎng)基分裝于試管中，約是試管長(zhǎng)度的13 。6 瓊脂平板：將滅菌 （或加熱融化） 后的培養(yǎng)基冷至50 左右，以無(wú)菌手續(xù)傾人 滅菌平皿內(nèi)，內(nèi)徑9cm 的平皿傾注培養(yǎng)基約13 15ml ，輕搖平皿底，使培養(yǎng)基平鋪于平 皿底部，待凝固后即成，傾注培養(yǎng)基時(shí)，切勿將皿蓋全部啟開(kāi)，以免空氣中塵埃及細(xì)菌 落入。新制成的平板培養(yǎng)基 （簡(jiǎn)稱(chēng)平板），表面水分較多，不利于細(xì)菌的分離，通常應(yīng)將 平皿倒扣擱置于37 培養(yǎng)箱內(nèi)約30 分鐘待平板平面干燥后使用。平板的放置：倒置。（原因：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置

17、，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。）（六） 滅菌不同成分、性質(zhì)的培養(yǎng)基，可采用不同的滅菌方法。 高壓蒸汽滅菌法：高壓滅菌的溫度與時(shí)間隨培養(yǎng)基的種類(lèi)及數(shù)量的不同有所差別，一般培養(yǎng)基少量分裝時(shí)高壓 （10343kPa） 滅菌15 分鐘即可，培養(yǎng)基分裝量較大時(shí)，可 高壓 （10343kPa） 滅菌30 分鐘，含糖的培養(yǎng)基高壓 （5516kPa） 滅菌15 分鐘。以免糖 類(lèi)被破壞。（七） 檢定每批培養(yǎng)基制成后須經(jīng)檢定方可使用，檢定時(shí)將培養(yǎng)基放37 溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 小時(shí) 后，證明無(wú)菌，同時(shí)用已知菌種檢查在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖及生化反應(yīng)情況，符合要求 者方可使

18、用。（八） 保存制好的培養(yǎng)基，不宜保存過(guò)久，以少量勤做為宜。每批應(yīng)注明名稱(chēng)，分裝量，制作 日期等，放在4 冰箱內(nèi)備用（短期保存）。長(zhǎng)期保存：甘油管藏法（在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在20的冷凍箱中保存）。四、平菇菌種制作技術(shù)（一）.平菇母種的制作 平菇母種配方：土豆 200 克、白糖 20 克、瓊脂 20 克、水 1000 毫升、蛋白胨3克、硫酸鎂 2 克、維生素 2 克。按配方精確稱(chēng)取，先將土豆去皮切片放入 1000 毫升水中，用文火煮沸 20 分鐘左右。然后過(guò)濾，加水再加熱，先將瓊脂、白糖、硫酸鎂、維生素煮至全部溶化，用量

19、杯量一下是否還夠 1000 毫升，如不足，用開(kāi)水補(bǔ)足。趁熱分裝試管中，每管裝 12毫升， 1000 毫升可分裝 80-100 支試管。分裝時(shí)要用長(zhǎng)管 漏斗，不要使培養(yǎng)基沾到試管口上，以免沾濕棉塞污染雜菌。塞棉塞要用普通棉花，塞 入試管要松緊合適。然后，每 10 支試管用皮套捆成一小捆，每 5 小捆再捆成一大捆，棉塞用牛皮紙包好，放入高壓鍋中 1.2 公斤壓力，滅菌 30 分鐘，停火。等 壓力表回零才能排氣開(kāi)鍋，取出試管傾斜排放在桌面上，斜面試管有兩種：原母種試管 - 斜 面長(zhǎng)度應(yīng)為管長(zhǎng)的 1/3 ，生產(chǎn)母種試管的斜 面應(yīng)為管長(zhǎng)的 1/2 ，冷卻凝固后，取一些試管放入恒溫箱中 27-30 度空白

20、培養(yǎng) 5天，經(jīng)無(wú)菌觀察，確認(rèn)無(wú)雜菌，才能大量用于分離制種或轉(zhuǎn)接生產(chǎn)母種。接種要在嚴(yán)格的無(wú)菌條件下進(jìn)行可以使用甲醛加高錳酸鉀消毒法，接種后放入 25 度的恒溫箱中培養(yǎng) 7-10 天，長(zhǎng)滿試管確認(rèn)無(wú)任何雜菌，就可用于轉(zhuǎn)接二級(jí)原種了。 （二）.平菇原種制作 配方 1 ：闊葉木鋸沫 80 斤、玉米面 25 斤、克霉靈 1 兩、白糖 1 斤、硫酸鎂 5 兩、磷酸二氫鉀 3 兩、石膏1 斤、碳酸鈣 1 斤。含水量 65% 。配方2 ：玉米芯 80 斤、稻糠 15 斤、夫子 10 斤、克霉靈 1 兩、白糖 1 斤、硫酸鎂 5 兩、磷酸二氫鉀 2 兩、尿素 3 兩、石灰 2 斤。含水量 65% 。配方 3 ：

21、闊葉木鋸沫 40 斤、玉米芯 40 斤、豆餅粉 10 斤、玉米面 10 斤、白糖 1 斤、克霉靈 1 兩、硫酸鎂5 兩、菇豐素 15 克、二氫鉀 3 兩、碳酸鈣 1 斤、石灰 1 斤。 含水量 65%.配方 4 ： 玉米 100 斤，磷酸二氫鉀 0 。 5 斤，硫酸鎂 0 。 5 斤，白糖 1 斤，碳酸鈣 2 斤， 629 消毒劑1 瓶。拌料：先將主料和夫子或玉米面、石膏、白灰干拌均勻。然后將其它藥品溶化于水中，形成濃的原液。然后把原液均勻加入水中拌入料里。拌勻、含水量掌握在 65% ，即拌完料后用手握一把料，手指縫有水滴但不下落。最好用“亞泰牌裝袋機(jī)”拌料，節(jié)省勞力、攪辦均勻，而且還可以裝多

22、種規(guī)格的菌袋，一機(jī)多用。裝瓶標(biāo)準(zhǔn)： 每瓶能裝干料 2.5 兩，裝完濕料連瓶稱(chēng)重應(yīng)為 1.1 斤，這就證明裝料量、松緊度都要適度。料中間打一個(gè)眼以利菌絲快速生長(zhǎng)，裝完瓶后馬上擦凈瓶身，蓋上丙烯塑料，套好皮套，進(jìn)行高壓滅菌 1.5 公斤壓力保持 2 小時(shí)以上。滅菌結(jié)束后，瓶溫降到 30 度以下搬入接種箱中，接種前必須進(jìn)行嚴(yán)格消毒 - 用 629 消毒劑或氣霧消毒盒或電子接種器配合使用。一支生產(chǎn)母種可轉(zhuǎn)接 5-8 瓶二級(jí)種，接完后馬上放入 25-27 度的恒溫箱中培養(yǎng)，沒(méi)有恒溫箱也可以放在能保持 25 度條件下培養(yǎng)。每 3-5 天檢查一次，把長(zhǎng)勢(shì)不好、不純的及時(shí)挑出。經(jīng) 25 天左右培養(yǎng)，就能長(zhǎng)滿瓶

23、，滿瓶后應(yīng)再鞏固培養(yǎng) 5 天，才能轉(zhuǎn)接三級(jí)種。二級(jí)種可采用12*24丙烯袋裝,因?yàn)楣揞^瓶不好買(mǎi),大規(guī)模制種都有采用塑料袋.原種制作要領(lǐng)：料要干，無(wú)變質(zhì)，加入原料必須精確，滅菌必須達(dá)到殺死一切微生物。接種要在絕對(duì)無(wú)菌條件下進(jìn)行，蓋瓶塑料必須用聚丙烯塑料，因?yàn)楸┧芰媳炔Ａн€透明，就是有小米粒大小的雜菌，也能清楚的觀察到。 （三）.栽培種的制作 栽培種配方可完全參照二級(jí)配方和制作方法，但培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)配比應(yīng)接近于栽培料，使菌絲有一個(gè)更適應(yīng)的過(guò)程.栽培料配方:配方1：棉子殼 100 斤，石灰 4 斤，硫酸鎂 4 兩，克霉靈 1 兩 ,尿素0.5斤,二氫鉀3兩,玉米面10斤,含水量65% 。配方2：棉子殼

24、 100 斤，石灰 1.5 斤，石膏 2 斤，克霉靈 1 兩，高錳酸鉀 1 兩。配方3：棉子殼 100 斤，生石灰 3 斤，磷肥 1.5 斤，尿素 2 兩，硫酸鎂 3 兩，克霉靈 1 兩，碳酸鈣 1 斤。配方4：玉米芯 100 斤，玉米面 25 斤，高錳酸鉀 1 兩，克霉靈 1 兩，磷酸二氫鉀 3 兩，尿素 3 兩，復(fù)合肥肥 3 兩，硫酸鎂 4 兩，碳酸鈣 1 斤，石灰 4 斤，菇豐素 15 克，大粒鹽 1 斤（發(fā)酵料添加）。配方5：玉米芯 100 斤，夫子 15 斤，米糠 20 斤，克霉靈 2 兩，尿素 5 兩，磷酸二氫鉀 3 兩，硫酸鎂 5 兩，石灰 3 斤，石膏 1 斤，增產(chǎn)素 1 支，

25、大粒鹽 1 斤（發(fā)酵料用）。配方6：花生殼粉 65 斤，玉米芯 35 斤，玉米面 5 斤，黃豆粉 10 斤，磷酸二氫鉀 5 兩，石灰 3-4 斤，克霉靈 1-2 兩，過(guò)磷酸鈣 5 兩，硫酸鎂 4 兩。配方7：豆秸粉 50 斤，木屑 30 斤，玉米芯 20 斤， 夫子 13 斤，玉米面 10 斤，石灰 4 斤，克霉靈 2 兩，過(guò)磷酸鈣 5 兩，尿素 4 兩，硫酸鎂 5 兩，菇豐素 15 克，碳酸鈣 1 斤。配方8：玉米芯 100 斤，玉米面 10 斤，黃豆粉 10 斤，米糠 5 斤，尿素 5 兩，復(fù)合肥 3 兩，硫酸鎂 3 兩，石灰 3 斤，過(guò)磷酸鈣 1 斤，克霉靈 2 兩。配方9：木屑 87%

26、 ，夫皮 5% ，玉米面 5% ，石灰、石膏、磷肥各 1% ，克霉增產(chǎn)靈 0.1% 。配方10：豆稈、木屑混合物 80 斤，夫皮 10 斤，雞糞 5 斤，玉米面 5 斤，豆餅 5 斤，石灰 4 斤，磷肥 1 斤，尿素 3 兩，克霉靈殺菌劑 2 兩，碳酸鈣 1 斤，硫酸鎂 5 兩,發(fā)酵期15-20天。 五平菇栽培料拌料要點(diǎn)： 1 料要新，不能有發(fā)霉、成團(tuán)、蟲(chóng)卵等。2 主料以復(fù)合料為好，養(yǎng)份全、透氣性好，有利于菌絲生長(zhǎng)，確保高產(chǎn)。即使是單一的使用一種主料如玉米芯，也要注意料的粗、細(xì)。 料、水比例，不同的原料在栽培時(shí)加入的水量是不同的，不能只根據(jù)以往的某一經(jīng)驗(yàn)一成不變。如棉子皮不脫絨時(shí)，料水比在 1

27、 ： 1 . 5 ，而脫絨的棉子皮在加水時(shí)，料水比在 1 ： 1 .3 左右。另外，原料的干、濕程度，原料的顆粒大小都影響拌料時(shí)的加水量。再有，質(zhì)的不同的原料吃水程度也不同，玉米芯原料拌完后 2 小時(shí)左右才能吃透水，也就是說(shuō)，要在拌完玉米芯主料悶 2 小時(shí)后，用手緊握一把料，手指間有水珠但不下落即為含水量 65% 。3 為達(dá)到主料與輔料等混合均勻，要先把主料、夫皮、玉米面、石灰、石膏干拌均勻，再把肥料、微量元素、殺菌劑、增 產(chǎn)劑溶于水中再均勻的加入主料中。一般發(fā)酵料在第二次翻堆時(shí)加入殺蟲(chóng)劑。另一個(gè)方法是干拌法,把所有的輔料都拌在一起,然后撒在主料的表面,干拌兩遍,再向料堆加清水,省工,快速,均

28、勻。六、地平菇培養(yǎng)過(guò)程和要點(diǎn)菌床播種培養(yǎng)收獲菌床處理1、菌床的制作過(guò)程：干稻草（1噸）用30%生石灰（200Kg生石灰、500Kg清水）左右浸泡三天。整理地面：1米寬、10米長(zhǎng)、0.3米深。地面要平、土壤要豐富。用生灰散一層，然后噴散高錳酸鉀溶液（濃度應(yīng)為）。上鋪用生石灰浸泡的稻草（厚5厘米左右）然后散上一層生石灰，再一層稻草，一層生石灰，如此反復(fù)6次。2、播種：把上面第一層稻草的1/2揭開(kāi)散上2厘米大的栽培種3-5個(gè)，距離5-8厘米，復(fù)原稻草。噴灑0.1%高錳酸鉀溶液。蓋上薄膜。3、培養(yǎng)：前三不管。每天把薄膜揭一下，蓋上，補(bǔ)充氧氣。4、收獲。摘在留小。注意不要污染菌床。5、菌床處理。生石灰散

29、菌床，深翻土。附錄：1、 微生物計(jì)數(shù)顯微鏡直接計(jì)數(shù)： 1.1學(xué)習(xí)接目測(cè)微計(jì)的校正方法， 了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和計(jì)數(shù)原理 1.2 學(xué)習(xí)使用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)定微生物細(xì)胞大小， 掌握用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物細(xì)胞總數(shù)的方法。 2.0原理 微生物細(xì)胞的大小是微生物分類(lèi)鑒定的重要依據(jù)之一。微生物個(gè)體微小，必須借助于顯微鏡才能觀察，要測(cè)量微生物細(xì)胞大小，也必須借助于特殊的測(cè)微計(jì)在顯微鏡下進(jìn)行測(cè)量。 顯微測(cè)微計(jì)由鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)和目鏡測(cè)微計(jì)兩部分組成。后者可直接用于測(cè)量細(xì)胞大小。它是一塊.圓形玻片(圖71)，其中央有精確等分到度，測(cè)量時(shí)將其放在接目鏡中的隔板上。由于目鏡測(cè)微計(jì)所測(cè)量的是微生物細(xì)胞經(jīng)過(guò)顯微鏡放大之后所成像

30、的大小，刻度實(shí)際代表的長(zhǎng)度隨使用的目鏡和物鏡放大倍數(shù)及鏡筒的長(zhǎng)度而改變，所以，使用前須先用鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)進(jìn)行標(biāo)定，求出某一放大率下，目鏡測(cè)微計(jì)每一小格所代表的長(zhǎng)度，然后用目鏡測(cè)微計(jì)直接測(cè)被測(cè)對(duì)象的大小。鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)是一塊中央有精確刻玻片(圖71)，刻度的總長(zhǎng)為lmm，等分為100小格，每小格長(zhǎng)10um，專(zhuān)用于對(duì)目鏡測(cè)微計(jì)進(jìn)行標(biāo)定的。 3.0 材料 3.1 器械 顯微鏡、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺，載玻片、蓋玻片、血球計(jì)算板、擦鏡紙、吸水紙、玻片架、腎形盤(pán)、洗瓶、接種環(huán)、酒精燈、火柴、滴管。 3.2 菌種 培養(yǎng)48h的啤酒酵母斜面菌體和菌懸液。 3.3 革蘭氏染液 4.0流程 4.1 置目測(cè)微計(jì)置臺(tái)測(cè)微計(jì)

31、標(biāo)定目測(cè)微計(jì)測(cè)菌體大小記錄結(jié)果用畢擦拭干凈 4.2 檢查計(jì)數(shù)板稀釋樣品加樣計(jì)數(shù)計(jì)算清洗 5 步驟 5.1 微生物菌體大小的測(cè)定 5.1.1 目鏡測(cè)微尺的校正 5.1.1.1 更換目鏡鏡頭 更換目鏡測(cè)微尺鏡頭（標(biāo)記為PF）；或者取下目鏡上部或下部的透鏡，在光圈的位置上安上目鏡測(cè)微尺，刻度朝下，再裝上透鏡，制成一個(gè)目鏡測(cè)微尺的鏡頭。 5.1.1.2 某一倍率下標(biāo)定目鏡刻度 將鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，使刻度面朝上，先用低倍鏡對(duì)準(zhǔn)焦距、看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器使兩尺重疊，并使二尺的左邊的某一刻度相重合，向右尋找另外二尺相重合的刻度。記錄兩重疊刻度

32、間的目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)(圖7-1C)。 5.1.1.3 計(jì)算該倍率下目鏡刻度 目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度=鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)/目鏡測(cè)微尺格數(shù)xl0um 5.1.1.4 標(biāo)定并計(jì)算其他放大倍率下的目鏡刻度 以同樣方法分別在不同倍率的物鏡下測(cè)定目鏡測(cè)微尺每格代表的實(shí)際長(zhǎng)度。如此測(cè)定后的測(cè)微尺的長(zhǎng)度，僅適用于測(cè)定時(shí)使用的顯微鏡以及該目鏡與物鏡的放大倍率。 5.1.2 菌體大小的測(cè)定 5.1.2.1 將啤酒酵母制成水浸片。 5.1.2.2 大小換算 將標(biāo)本先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)定每個(gè)菌體長(zhǎng)度和寬度所占的刻度，即可換算成菌體的長(zhǎng)和寬。 5.1.2.3 求平均值 一般測(cè)量

33、微生物細(xì)胞的大小，用同一放大倍數(shù)在同一標(biāo)本上任意測(cè)定l0一20個(gè)菌體后，求出其平均值即可代表該菌的大小。 5.2 用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物細(xì)胞的數(shù)量 5.2.1 檢查血球計(jì)數(shù)板 取血球計(jì)數(shù)板一塊，先用顯微鏡檢查計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，看其是否沾有雜質(zhì)或干涸著的菌體，若有污物則通過(guò)擦洗、沖洗，使其清潔。鏡檢清洗后的計(jì)數(shù)板，直至計(jì)數(shù)室無(wú)污物時(shí)才可使用。 5.2.2 稀釋樣品 將培養(yǎng)后的酵母培養(yǎng)液振蕩振搖混勻，然后作一定倍數(shù)的稀釋。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數(shù)為宜。一般以每小格內(nèi)含45個(gè)菌體的稀釋度為宜。 5.2.3 加樣 取出一塊干凈蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板中央。用滴管取1滴菌稀釋?xiě)乙鹤⑷肷w玻片邊緣，讓

34、菌液自行滲入，若菌液太多可用吸水紙吸去。靜置510分鐘。 5.2.4 鏡檢 待細(xì)胞不動(dòng)后進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)。先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室方格后，再用高倍鏡測(cè)數(shù)。一般應(yīng)取上下及中央五個(gè)中格的總菌數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)若遇到位于線上的菌體，一般只計(jì)數(shù)格上方（下方）及右方（左方）線上的菌體。每個(gè)樣品重復(fù)3次。 5.2.5 計(jì)算 取以上計(jì)數(shù)的平均值，按下列公式計(jì)算出每毫升菌液中的含菌量。 菌體細(xì)胞數(shù)（cfu/mL）小格內(nèi)平均菌體細(xì)胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù) 5.2.6 清洗 計(jì)數(shù)板用畢后先用95%的形酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然后吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。若計(jì)數(shù)的樣品是病原微生物，則須先浸

35、泡在5%石炭酸溶被中進(jìn)行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。 圖7-2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 6 結(jié)果 6.1計(jì)算出目鏡測(cè)微尺在低、高倍鏡下的刻度值。 6.2 記錄菌體大小的測(cè)定結(jié)果。 6.3 計(jì)算樣品中酵母菌濃度。 7 思考 7.1 為什么隨著顯微鏡放大倍數(shù)的改變，目鏡測(cè)微計(jì)每格相對(duì)的長(zhǎng)度也會(huì)改變？能找出這種變化的規(guī)律嗎？ 7.2 根據(jù)測(cè)量結(jié)果，為什么同種酵母菌的菌體大小不完全相同？ 7.3 能否用血球計(jì)數(shù)板在油鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)？為什么？ 7.4 根據(jù)自己體會(huì)，說(shuō)明血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自那些方面？如何減少誤差？ 8.0備注 目鏡測(cè)數(shù)尺有兩種：一是特制的目鏡鏡頭，鏡片上刻有50等分或

36、100等分的刻度，使用時(shí)直接安裝在顯微鏡上，取代沒(méi)有刻度的目鏡鏡頭；另一種是一塊直徑大約17.5 mm的圓玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度(圖7-1A)，使用時(shí)將該玻璃片安裝在原來(lái)的目鏡鏡頭上即可。由于不同的顯微鏡放大倍數(shù)不同，既使同一顯微鏡在不同的目鏡、物鏡組合下其放大倍數(shù)也不同，故目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際表示的長(zhǎng)度隨顯微鏡放大倍數(shù)不同而異。也就是說(shuō)，目鏡測(cè)微尺上的刻度只代表相對(duì)的長(zhǎng)度。因此在使用前須用鏡臺(tái)測(cè)微尺校正，以確定在一定放大倍數(shù)下目鏡測(cè)微尺的每格長(zhǎng)度。 血球計(jì)數(shù)板是一塊特別的厚玻片，玻片中央分剖成兩個(gè)平面，上面各刻有9區(qū)，中央一區(qū)為計(jì)數(shù)室，供計(jì)數(shù)用(圖7-2A)，此區(qū)的長(zhǎng)和寬

37、各為1mm。中央平面兩側(cè)有小溝，小溝外有兩條突起的平臺(tái)，平臺(tái)比中央平面高0.1mm，因此計(jì)數(shù)室體積為0.1mm3，容積為10-4ml。通常計(jì)數(shù)室分為25個(gè)大格，每大格又分為16個(gè)小格，每小格容積為4×10-6ml，即lml菌液容積相當(dāng)于400萬(wàn)個(gè)小格體積。因此只要將細(xì)胞懸液注人計(jì)算室，計(jì)算出一定數(shù)量小格的平均菌數(shù)即可算出每毫升的細(xì)胞數(shù)。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法基本原理利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（ 01mm2），

38、所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)?yè)Q算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱(chēng)為總菌計(jì)數(shù)法。血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖-1。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格（圖-2）；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格（圖-1，C）。但無(wú)論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都

39、是相同的，即16×25=400小方格，如圖-2。每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為01mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為01mm3。在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。下面以一個(gè)大方格有25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算：設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)大方格中的總菌數(shù)因1ml=1cm3=1000mm3， （即0.1mm3中的細(xì)菌總數(shù)）=A*B*25/5 故1ml菌液中的總細(xì)菌數(shù)=A*25*10*1000*

40、B/5 =50000A·B（個(gè)）二、器材釀酒酵母菌懸液，血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)管。三、操作步驟1稀釋將釀酒酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)喝绮粷猓刹槐叵♂尅?鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。3加樣品將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的細(xì)口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過(guò)多），讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。4顯微鏡計(jì)數(shù)靜止5分鐘后，將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太

41、稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有510個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。5清洗血球計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 平板菌落計(jì)數(shù)法一、基本原理平板菌落計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞

42、繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說(shuō)一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，先將待測(cè)樣品作一系列稀釋?zhuān)偃∫欢康南♂尵航臃N到培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)。這種計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是能測(cè)出樣品中的活菌數(shù)。此法常用于某些成品檢定（如殺蟲(chóng)菌劑），生物制品檢定以及食品、水源的污染程度的檢定等。但平板菌落計(jì)數(shù)法的手續(xù)較繁，而且測(cè)定值常受各種因素的影響。二、器材大腸桿菌懸液，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基， 1ml無(wú)菌吸管，無(wú)菌平皿，盛有4 5 ml無(wú)菌水的試管，試管架和記號(hào)筆等。三、操作步驟1編號(hào)：取無(wú)菌平皿 9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-4、

43、10-5、10-6各3套。另取6支盛有45ml無(wú)菌水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2稀釋用1ml無(wú)菌吸管精確地吸取05ml大腸桿菌懸液放入10-1的試管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出時(shí)，管內(nèi)液體外溢。然后仍用此吸管將管內(nèi)懸液來(lái)回吸吹三次，吸時(shí)伸入管底，吹時(shí)離開(kāi)水面，使其混合均勻。另取一支吸管自10-1試管吸05ml放入10-2試管中，吸吹三次，其余依次類(lèi)推。整個(gè)稀釋過(guò)程如圖-3。3取樣用3支1ml無(wú)菌吸管分別精確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液02ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無(wú)菌培養(yǎng)皿中。4倒平板于上述盛有不同稀釋度菌

44、液的培養(yǎng)皿中，倒入溶化后冷卻至45左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基約1015ml，置水平位置，迅速旋動(dòng)混勻，待凝固后，倒置于37溫室中培養(yǎng)。5計(jì)數(shù)培養(yǎng)24小時(shí)后，取出培養(yǎng)皿，算出同一稀釋度三個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算：每毫升中總活菌數(shù)=同一稀釋度三次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5一般選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的菌數(shù)最為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)的菌數(shù)不能相差很懸殊。由10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中總活菌數(shù)也不能相差懸殊，如相差較大，表示試驗(yàn)不精確。平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般以三個(gè)稀釋度

45、中的第二稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。平板菌蓓計(jì)數(shù)法的操作除上述的以外，還可用涂布平板的方法進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于 37溫室中烘烤30分鐘左右，使其干燥，然后用無(wú)菌吸管吸取 02ml菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，再用無(wú)菌玻璃刮棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上2030分鐘，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后再倒置于37的溫室中培養(yǎng)。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 環(huán)境因素對(duì)微生物的影響微生物的生命活動(dòng)要求一定的外界環(huán)境條件，外界環(huán)境條件適宜時(shí)，微生物進(jìn)行正常生長(zhǎng)繁殖；不適宜時(shí)，則會(huì)使微生物生長(zhǎng)

46、受到抑制或發(fā)生變異，甚至死亡。不同的環(huán)境因素對(duì)微生物的影響不同；同一因素因濃度或作用時(shí)間不同，對(duì)微生物的影響也不一樣；有的因素對(duì)某些微生物來(lái)講是必需的，而對(duì)另一些微生物又是有害的，如好氧微生物必須在有氧條件下才能生長(zhǎng)繁殖，而厭氧微生物在有氧情況下將會(huì)受到抑制。在有害因素中，有的起抑制作用；有的表現(xiàn)為殺菌作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)化學(xué)、物理、生物和營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境因素對(duì)微生物影響的了解，以便為有益微生物創(chuàng)造適宜的生存條件，而對(duì)有害的微生物則設(shè)法控制或殺滅，使微生物能更好地為人類(lèi)所利用。 生物基本知識(shí)->實(shí)驗(yàn)三十三 化學(xué)因素對(duì)微生物的影響 化學(xué)因素對(duì)微生物的影響一、基本原理常用的化學(xué)消毒劑主要有重金屬及其鹽

47、類(lèi)，酚、醇、醛等有機(jī)化合物以及碘、表面活性劑等。它們的殺菌或抑菌作用主要是使菌體蛋白質(zhì)變性，或者與酶的SH基結(jié)合而使酶失去活性所致。本實(shí)驗(yàn)是觀察某些常用的化學(xué)藥品在一定濃度下對(duì)微生物的致死或抑菌作用，從而了解它們的殺菌或抑菌性能。為了比較各種化學(xué)消毒劑的殺菌能力，常以石炭酸為標(biāo)準(zhǔn)，即將某一消毒劑作不同稀釋后，在一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)致死全部供試微生物的最高稀釋濃度，與達(dá)到同樣效果的石炭酸的最高稀釋度的比值，稱(chēng)為這種消毒劑對(duì)該種微生物的石炭酸系數(shù)（酚系數(shù)）。石炭酸系數(shù)越大，說(shuō)明該消毒劑殺菌能力越強(qiáng)。二、器材大腸桿菌，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基

48、，25碘酒，01升汞（HgCl2），5石炭酸，75酒精，1來(lái)蘇爾，025新潔爾滅， 0005龍膽紫，005龍膽紫；培養(yǎng)皿，濾紙片，試管，吸管等。三、操作步驟1各種化學(xué)藥品的殺菌作用(1)用無(wú)菌吸管吸取培養(yǎng)18小時(shí)的白色葡萄球菌菌液02ml于無(wú)菌平皿內(nèi)。(2)倒入已溶化并冷至45左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基于上述平皿內(nèi)，充分搖勻，水平放置，待凝。(3)將上述已凝固的平皿用記號(hào)筆在平皿底劃成八等份，每一等份內(nèi)標(biāo)明一種藥物的名稱(chēng)。(4)用無(wú)菌鑷子將小圓形濾紙片分別浸入各種藥品中，取出，并在試管內(nèi)壁上除去多余藥液后，以無(wú)菌操作將紙片對(duì)號(hào)放入培養(yǎng)皿的小區(qū)內(nèi)，如圖-1。(5)將上述放好濾紙片的含菌平皿，倒

49、置于37溫室中培養(yǎng)24小時(shí)后，取出測(cè)定抑菌圈大小，并說(shuō)明其殺菌強(qiáng)弱。2石炭酸系數(shù)的測(cè)定（1）將5（1：20）的石炭酸液按表-1配成不同濃度，每管5ml。（2）將待測(cè)藥物（來(lái)蘇爾）先配成1：20的原液，再按表-2配成不同濃度，每管 5ml。 （3）取肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基30管，115管標(biāo)明石炭酸的5種濃度，每種濃度3管，每3管分5、10、15分鐘處理，1630管標(biāo)明來(lái)蘇爾的5種濃度，同樣每種濃度3管，每3管分5、10、15分鐘處理。 （4）在上述不同濃度的石炭酸和來(lái)蘇爾溶液中，各接入05ml大腸桿菌液，搖勻。注意每管自接種時(shí)起在5、10、15分鐘，用同一接種環(huán)從各管內(nèi)取一環(huán)接入上述已標(biāo)記的液體培

50、養(yǎng)基試管中。（5）置37溫室中培養(yǎng) 48小時(shí)，觀察并記錄生長(zhǎng)情況。生長(zhǎng)者溶液混濁，以“+”表示；不生長(zhǎng)者溶液澄清，以“-”表示。（6）計(jì)算系數(shù)值 找出在5分鐘生長(zhǎng)，而在10分鐘和15分鐘均不生長(zhǎng)的石炭酸及來(lái)蘇爾的最大稀釋度，計(jì)算二者的比值。例如石炭酸在10分鐘內(nèi)殺死大腸桿菌的最大稀釋度是1：70，來(lái)蘇爾是1：250，則來(lái)蘇爾的石炭酸系數(shù)為250/70=36。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)三十四 氧對(duì)微生物的影響一、基本原理各種菌對(duì)氧的要求是不同的，根據(jù)它們對(duì)氧的要求或所能耐受的量可將細(xì)菌分為四個(gè)類(lèi)型。專(zhuān)性好氧菌必須在有氧的情況下生存，例如枯草芽孢桿菌；專(zhuān)性厭氧菌則要求在完全無(wú)氧的條件下生長(zhǎng)繁殖，分子氧對(duì)它

51、們有害，例如破傷風(fēng)梭菌（Clostridiumtetani）、丙酮丁醇梭菌（Cacetobutylcum）等；兼性厭氧菌無(wú)論在有氧或無(wú)氧的情況下均能生長(zhǎng)，一般在有氧情況下生長(zhǎng)快，例如酵母菌、腸道桿菌等屬于兼性厭氧菌；微好氧菌適宜于在氧濃度較低的環(huán)境中生長(zhǎng)，例如鏈球菌屬中的個(gè)別種。本實(shí)驗(yàn)采用深層瓊脂法來(lái)測(cè)定氧對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，在葡萄糖牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基試管中接入某種細(xì)菌，通過(guò)適宜的培養(yǎng)條件，若細(xì)菌只生長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面，則為好氧菌；只生長(zhǎng)在培養(yǎng)基底部，為厭氧菌；若表面及全部培養(yǎng)基中都生長(zhǎng)，為兼性厭氧菌；生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中上部，為微好氧菌（圖-2）。這樣，根據(jù)細(xì)菌在試管培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的部位，就可以判斷各

52、種細(xì)菌對(duì)氧的需要程度。二、器材大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，丙酮丁醇梭菌；肉膏蛋白胨瓊脂試管培養(yǎng)基4支。三、操作步驟1將肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基試管置于水浴鍋中加熱溶化。2待培養(yǎng)基冷卻至50左右時(shí)，按無(wú)菌操作分別用接種環(huán)接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、丙酮丁醇梭菌各一環(huán)于試管培養(yǎng)基中，另一支試管中不接種作對(duì)照。搓動(dòng)試管，使細(xì)菌均勻混于培養(yǎng)基內(nèi)。3待凝固后，置于28溫室中培養(yǎng)48小時(shí)后開(kāi)始觀察，連續(xù)觀察幾天，直至結(jié)果清晰時(shí)為止。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)三十五 溫度對(duì)微生物的影響基本原理溫度是影響微生物生長(zhǎng)與存活的重要因素之一。當(dāng)微生物處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，有刺激生長(zhǎng)的作用；不適宜的溫度可以導(dǎo)致細(xì)菌的形態(tài)和代謝的改變或

53、使微生物的蛋白質(zhì)凝固變性而導(dǎo)致死亡。不同的微生物對(duì)溫度的抵抗力不同，如大腸桿菌在6010分鐘內(nèi)致死，而枯草芽孢桿菌在100617分鐘內(nèi)才能致死，這是因?yàn)檠挎卟粌H含水量低，有厚而致密的壁，而且還含有特殊的物質(zhì)吡啶二羧酸，所以芽孢桿菌的抗熱能力比大腸桿菌強(qiáng)。二、器材大腸桿菌，枯草芽孢桿菌；肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基試管16支，吸管，恒溫水浴，溫度計(jì)等。三、操作步驟1將培養(yǎng)48小時(shí)的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌斜面加入無(wú)菌生理鹽水各5ml，用接種環(huán)刮下菌體，制成菌懸液。2取肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基試管16支，從1至16編號(hào)并注明各管所接菌種的名稱(chēng)和處理的溫度及時(shí)間。3在單號(hào)1、3、5、7、9、11、13、15管中各接入大腸桿菌懸液02ml，在雙號(hào)2、4、6、8、10、12、14、16管中各接入枯草芽孢桿菌懸液02ml。4將已接種的18管同時(shí)放入50水浴中，10分鐘后取出第14管。再過(guò)10分鐘（即處理20分鐘）后取出第58管；同法將接過(guò)菌種的第916管同時(shí)放入100水浴中，10分鐘后取出第912管。再過(guò)10分鐘（即20分鐘）后取出第1316管。5上述各管取出后，立即用冷水沖涼，然后置37恒溫室內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察生長(zhǎng)情況。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 滲透壓對(duì)微生物的影響 一、基本原理若將細(xì)菌置于低滲液或水中，菌體因吸