1、生物工程專業實驗講義適用于生物工程專業 曹飛制藥與生命科學學院二零零九年四月目錄實驗一 發酵種子的制備1實驗二 E.COli 和 Pseudomonas dacunhae 2021 發酵培養2實驗三高速冷凍離心機的使用方法.3實驗四固定化生物催化劑的制備4實驗五游離細胞與固定化細胞酶活比擬 5實驗六固定化生物催化劑的連續生產6實驗七L- Asp的別離 7實驗八L- Asp脫羧反響制備 L-Ala 6實驗九離子交換樹脂別離L- Al a8實驗原理:HOOCCOOH +實驗流程:、實驗原理與實驗流程En zyme 1NH3-HOOCNH2XCOOHEn zyme 2NH2PS20217離子交換樹脂

2、預處理L 丙氨酸培養基配制滅菌實驗一發酵種子的制備一、目的要求了解實驗室種子制備過程。二、原理種子制備過程包括瓊脂斜面、固體培養基擴大培養、搖瓶液體培養和種子罐 培養等多級擴大培養。在實驗室里，一般只進行到搖瓶液體培養獲得發酵用種子。 不同菌種其具體制備方法不同，下列圖是菌種子制備過程示意圖。生產種子制備的一般流程三、試驗及器材1. 菌種：斜面低溫保藏的大腸桿菌 E.coli 和Pseudomonasdacunhae202172. 培養基： E.coli種子培養基：牛肉膏 0.5%、NaCl 0.5%、 蛋白胨1%、 pH 7.67.8P.dacunhae 20217種子培養基：15g/L谷氨

3、酸鈉、蛋白胨8g/L、玉米漿5.5 g/L , KH 2PQ 0.5g/L ,MgSO 4 0.1g/L。3. 器材：天平、滅菌鍋、試管、三角瓶500mL四、操作方法1. 按種子培養基配方分別配制1000mL液體培養基，分裝于三角瓶中，每 瓶100mL，壓力1Kg/cm2滅菌30mins，結束后取出。2. 挑一環斜面低溫保藏的 E.coli和P.dacunhae 20217接于各自的種子培養 基中，37T培養24hs，轉速約150rpm。3. 種子瓶搖好后，及時接種到發酵罐。也可以在冰箱中短時間保藏。五、思考與討論1. 實驗室種子制備的原那么是什么？2. 哪些參數對于實驗室種子制備產生影響？實

4、驗二 E.coli 和 Pseudomonas dacunhae2021 發酵培養一、目的要求1了解發酵罐的結構，掌握發酵罐的根本操作技術。2了解發酵罐中微生物生長的生長特征。3. 掌握實驗室中微生物從斜面f搖瓶f發酵罐的無菌操作培養技術，對工 業化微生物生產過程作出初步了解。4. 掌握酶合成代謝調控機制。5. 掌握發酵工藝控制工藝。二、原理一定數量的微生物，接種于適宜的新鮮培養基中，在適宜的培養條件下，所 表現出的群體生長特征可分為四個時期，即延遲期、對數期、穩定期和衰亡期。 微生物在各個時期的生理特征各不相同。微生物的生長過程是其總的代謝活動的綜合表達， 每一種代謝途徑均由一些 特有的酶的

5、反響組成，同時微生物代謝具有高度的調節作用，通過本實驗了解酶 合成的調節機制之一酶合成的誘導。三、試劑及器材1. 菌種：實驗一液體培養 24h的E.coli和P.dacunhae 20217的實驗室種子2. 發酵培養基：E.coli 發酵培養基：玉米漿 4%、富馬酸 1%、K2HPO40.5%、MgSO40.25%、 NaCI0.1% (用氨水溶解富馬酸后再參加玉米漿和其他成分，用稀鹽酸調節 pH為 7.5)，消泡劑 1-2mL，pH 7.5。P.dacunhae 20217發酵培養基：20g/L谷氨酸鈉、蛋白胨10 g/L、玉米漿 20 g/L , KHPO0.5g/L ,MgSO 0.1

6、g/L、消泡劑 1-2mL，用氨水調 pH 至。121T，滅菌 20min。通氣，冷卻至 37C (E.coli)或 30C (P.dacunhae 20217)。4. 器材：發酵罐、滅菌鍋、721分光光度計、超凈工作臺、臺式高速離心機、 離心管、移液管。四、操作方法1. 按配方先后配制1000mL發酵培養基，調pH7.5,裝入發酵罐中，包扎好各個進氣口、出氣口和取樣口，保持121C下滅菌30mins,結束后取出放在發酵罐臺上冷卻。2. 待發酵點中的培養基冷卻至 37C( E.coli)或30C( P.dacunhae 20217) 左右時，用火環接種法將E.coli和P.dacunhae 2

7、0217種子液接發酵罐 中，接種量1015%控制溫度37C或30C，轉速約為300rpm,空氣流 速1L/min，發酵培養時間E.coli約12h、20217約18h，其中每間隔1-2hr 取樣測pH值和OD660值(樣品進行適當稀釋)紀錄發酵全過程中 pH值 和發酵液顏色變化，過程中鏡檢菌體生長形態變化情況。3. 發酵結束后放罐、收集發酵液并測量其總體積(V)。吸取1 mL發酵液 于離心管中，放入臺式高速離心機中離心，轉速 8000 rpm，時間10 min， 測濕菌體重(W 計算發酵產菌率。五、實驗記錄E.coli 發酵：時間(h)0246789101112六、思考與討論1發酵培養基中碳、

8、氮源是什么？為什么采用富馬酸、L-谷氨酸為碳源?2 如何提高發酵效率。3.討論酶合成生產的調節方式。OD640pH顏色實驗三高速冷凍離心機的使用方法一、目的要求1了解高速冰凍離心機的結構、使用方法及考前須知。2. 掌握生物物質、微生物菌體離心別離的原理。二、原理離心機是利用離心力對混合溶液進行別離和沉淀的一種專用儀器，高速冰凍離心機在實驗室別離和制備工作中是必不可少的工具，其最高速度可以到達 25000 rpm,最大離心力可達89000g。這類離心機通常帶有冷卻離心腔的制冷設 備，溫度控制是由裝在離心腔內的熱電偶檢測離心腔的溫度。高速冰凍離心機有多個內部可變換的角式或甩平式轉頭，它們大多用于收

9、集微生物菌種細胞碎片， 大的細胞器以及一些沉淀物等。三、試劑與器材E.coli發酵液、天平、高速冰凍離心機、離心管四、操作方法1. 使用前先檢查調速旋鈕、定時旋鈕等是否在“ 0處，離心管是否泄漏。2. 選擇適宜的轉頭安裝到離心腔內承載轉頭的軸上。3. 接通電源，翻開電源開關。4. 將待離心的液體裝入適宜的離心管中，盛量不宜過多占管的2/3體積以免益處，蓋上離心管蓋，精密平衡離心管，并對稱的放入轉頭中。5. 調節速度旋鈕和定時旋鈕，至所需的速度和時間。6. 翻開起動開關，并觀察離心機上的各個指示儀表是否正常工作。7. 離心結束后自動關機、關閉冷凍開關、電源開關、切斷電源。8. 將轉頭取出，將離心

10、機的蓋子敞開放置。9. 收集離心物，洗凈離心管。五、實驗記錄：發酵液體積，濕菌體重量 ，單位體積菌體得率，六、考前須知1. 高速離心機的轉頭是鑲置在一個較細的軸上，因此精密的平衡離心管及內含 物是十分重要的。2. 當轉頭只是局部裝載時，管子必須相互對稱的放在轉頭上，以便使負載均勻 地分布在轉頭的周圍。3. 裝載溶液時，要根據離心管的具體操作說明進行，要根據離心液體的性質、 體積選擇適宜的離心管，液體不得裝的過多，以防離心時甩出，造成轉頭生銹或 者腐蝕。4. 每次使用時，要仔細檢查轉頭，及時清洗、擦干，轉頭是離心機中須重點保 護的部件，搬動時不能碰撞，防止造成傷痕。轉頭長時間不用時，要涂一層光蠟

11、 保護。5. 轉頭在使用前應放置在冰箱或置于離心機的轉頭室內預冷。6. 離心過程中不得隨意離開，應隨時觀察李新機上儀表是否正常工作，并注意 聲音有無異常，以便及時排除故障。實驗四固定化生物催化劑的制備一、目的要求1學會卡拉膠固定大腸桿菌的操作方法2了解工業化固定生物催化劑的工藝過程二、原理酶和細胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、共價鍵結合法和交聯法等。本實驗通過卡拉膠包埋法固定大腸桿菌細胞，掌握包埋法固定細胞的操作方法。卡拉膠是由角叉菜提取的一種多糖，它含有許多硫酸根多糖，在存在下,它能立即發生凝膠作用，由此形成的固定化顆粒能在磷酸緩沖液和其他電解質溶 液中使用，其穩定性不受影響。卡拉膠包埋法

12、即溫和又簡單，可供多種酶和細胞 固定化使用。三、試劑及器材大腸桿菌細胞、卡拉膠、KCl、電爐、天平、恒溫水裕鍋、量筒、小刀、燒 杯四、操作方法1配制4%卡拉膠水溶液(A)，并冷卻至5560C。2配制菌懸液(B)，按濕細胞重與蒸餾水為1: 1 (g/mL)配制，并預熱至 5560C。3將A與B按4: 1 (mL/mL )混勻，冷至10C使凝膠強化，把所形成的 凝膠浸在0.3MKCI溶液中。4. 取出凝膠切成5X5mn大小的小塊。5測定固定化細胞顆粒的密度、床層空隙率、計算單位體積或重量固定化 顆粒中細胞包埋量。五、實驗記錄：固定化細胞重量，六、思考與討論影響卡拉膠固定化細胞顆粒機械強度的因素有哪

13、些？實驗五 游離細胞與固定化細胞酶活比擬一、目的要求掌握酶活測定和計算方法二、原理天門冬氨酸酶是催化富馬酸和氨轉化形成L-Asp的酶：NH2Ho。一 COOH + nHsHOOCCH測定發酵過程中游離細胞酶活和固定化E.coli細胞酶是評價發酵培養條件和固定化方法對大腸桿菌生產 L-Asp能力影響的重要指標之一。三、試劑與器材1試劑：富馬酸、氨水2器材：752分光光度計、離心機、電爐、三角瓶、燒杯四、操作方法1. 富馬酸標準曲線制作測定范圍 525/mL精確稱取0.5000g富馬酸，配制成0.5mg/mL母液，分別吸取母液0.1 ,0.2 , 0.3 , 0.4 和 0.5mL 母液，定容至

14、10mL 即成 5, 10, 15, 20, 25 卩g/mL富馬酸標準溶液，測定各標準液 OD4o值，繪制成標準曲線。2. 1M富馬酸銨底物配制：內含 1mM MgC2, pH為8.53. 游離細胞酶活力測定稱lg濕細胞，參加30mL底物溶液，于37C下振蕩反響1h,取出沸 水滅活，終止反響，離心，取上清液，進行適當稀釋，測OD4。4. 固定化細胞顆粒酶活力測定稱相當于1g濕細胞的固定化細胞顆粒，加 30ML底物，于37E振蕩反響1h,取樣離心，適當稀釋，測 OD4。1 pg分子底物的酶量定5. 酶活定義：與上述反響條件下，每小時消耗 義為一個酶活單位。五、實驗記錄：富馬酸標準曲線：濃度ug

15、/mL051015202530OD240游離酶活力 固定化細胞活力 有效因子六、思考與討論1. 為什么采用紫外吸收能夠測定酶活力？2. 計算游離細胞和固定化細胞酶活力，并進行比擬，討論影響固定化細胞 的酶活力的因素。實驗六固定化生物催化劑的連續生產一、目的要求了解固定化生物反響器的性能與反響器操作之間的關系二、原理添裝于固定床反響器中的具有天門冬氨酸酶活性的固定化大腸桿菌顆粒能連續的利用富馬酸和氨作為底物，使之轉變為L-Asp，其實驗流程如下：底物貯槽一恒流泵一恒溫固定床反響器一產品液貯槽在其它反響條件不變的情況下，反應器的性能隨反響器的操作流量即原料液在反響器中的停留時間而變化。三、試劑及器

16、材1 M富馬酸銨底物內含1m MgC2 pH8.5 、固定床反響器、恒流泵、超級 恒溫水浴鍋、752分光光度計、燒杯、乳膠管。四、操作方法1. 將具有天冬氨酸酶活性的固定化大腸桿菌顆粒裝入固定床反響器中。 連續底物貯槽、循環水等，控制恒溫 37 C2. 調節恒流泵至一流量，待反響器流動穩定后測體積流量，并每隔0.5h取樣測0D4。值。3. 連續轉化4-6h生產L-Asp，測定最終ODk,計算富馬酸轉化率。五、實驗記錄：反響器體積 固化細胞體積 床層空隙率時間h00.511.522.534OD240實驗七 L-Asp的別離一、目的要求掌握發酵液轉化液預處理方法 掌握等電點沉淀法別離氨基酸的方法二

17、、原理富馬酸銨底物在天冬氨酸作用下轉化為 L-Asp，轉化液在低離子強度下，調 pH值至等電點pl2.8使L-Asp所帶的靜電荷為零，可大大降低L-Asp溶解度， 使L-Asp沉淀出來。所得L-Asp結晶用水洗滌，不需進行重結晶，即可制得純品。三、試劑及器材60% HSO、活性炭、布氏漏斗、電爐、烘箱、燒杯四、操作方法1. 過濾轉化液，除去其中顆粒狀雜質，參加活性炭脫色，然后過濾，收集溶液、 測定其體積。2. 加熱濾液至90C,用60%2SQ調pH至2.8，然后在15C下保溫2h,即有L-Asp 結晶析出。3. 過濾收集L-Asp晶體，用蒸餾水淋洗，過濾得 L-Asp純晶體。4. 于烘箱中60

18、E烘干至恒重，稱重。五、實驗記錄：L-Asp 質量 ，單位時間生產能力，六、思考與討論1. 計算L-Asp理論得率和實際收率，并對結果進行討論。2. 計算固定化反響器生產L-Asp能力并討論之單位時間反響器生產 L - ASP量固定化反響器中生產能力=反響器中顆粒床層總體積實驗八 L- Asp脫羧反響制備L-Ala目的要求掌握L-Asp生物脫羧反響制備L-Ala的方法，以及反響-別離耦合方法制備 L-Ala的根本原理。二、原理NH2NH2HOOC COOHHOOC采用具有L-天冬氨酸脫羧酶的P.dacunhae 20217發酵液，在pH5-6的條件 下，不斷催化L-天冬氨酸脫羧產生L-丙氨酸。

19、L-天冬氨酸在水溶液中溶解度較 小，以固體形式存在，反響過程中伴隨著脫羧產生大量的CO氣泡，而產生的L-丙氨酸的溶解度較大，能夠局部溶解在發酵液中。但隨著L-丙氨酸的不斷生成，超過其飽和溶解度，就會在反響器內析出。此后再添加L-天冬氨酸進行脫羧反應，就會形成邊底物溶解反響、邊產物生成析出的、連續的反響-別離耦合過程。三、試劑及器材P.dacunhae 20217發酵液、L-Asp、三角瓶、搖床。四、操作方法1. 取兩個三角瓶，各放置 P.dacunhae 20217發酵液100mL參加0.05gEDTA2. 各稱取5g L-Asp參加到發酵液中，控制pH5-6,放置在搖床上，控制37C,轉速低

20、于50rpm,進行轉化；3. 待反響2h后，測定轉化液pH值，觀察搖瓶內底物是否溶解完全，是否產生氣泡。假設已經完全溶解并產生大量氣泡，那么補加2g L-Asp，調節pH5-6。4. 此后，每隔1h觀察一次，并補加2g L-Asp ;5. 待反響10h后，將其中一瓶取下，準備進行離交別離，另外一瓶繼續進行補加L-Asp至出現L-Ala晶體。五、實驗記錄：1、 參加L-Asp量，2、取初始參加L-Asp、轉化6h和12h的轉化液進行紙層析，觀察轉化 情況。六、思考與討論1. 反響-別離耦合反響過程有哪些類型？2. 參加EDTA勺目的是什么？實驗九 離子交換法別離 L-Ala一、目的要求1. 學會

21、離子交換樹脂的預處理方法。2. 掌握離子交換樹脂的作用原理和操作技術。二、原理 離子交換樹脂是一種合成的高聚物， 不溶于水，能吸水膨脹。 高聚物分子由 能電離的性基團及非極性的樹脂組成。 極性基團上的離子能與溶液中的離子起交 換作用，而非極性的樹脂本身物性不變。 通常離子交換樹脂按所帶的基團分為強 酸=R= S03H弱=COOH強堿=Nu R:和弱堿=NH舉 NH陰 NR2。離子交換樹脂別離小分子物質如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比擬理想的。 但對生物大于物質如蛋白質是不適當的，因為它們不能擴散到樹脂的鏈狀結構 中。故如別離生物大子、 可選用以多糖聚合物如纖維素、 葡聚糖為載體的離子交 換劑。本實驗用磺酸陽離子交換樹脂別離酸性氨基酸 天冬氨酸 、中性氨基酸 丙氨酸 的混合液。在特定的 pH 條件下，它們解離程度不同，通過改變脫液的 pH或離子強度可分別洗脫別離。三、試劑與器材 層析柱；磨口滴液漏斗；試管及試管架；紫外分光光度計、磺酸陽離子交換樹脂 732樹脂，交換容量 4.5mmol/g 、 2molL HCl、2molL NaOH