1、資料內容僅供您學習參考，如有不當或者侵權，請聯系改正或者刪除。目的 : 建立微生物限度檢查的標準操作規程 , 為微生物檢驗人員提供正確的操作方法。范圍 : 適用于輔料、 內包材料和所有產品的微生物限度檢查。職責 : 檢驗人員對本規程的實施負責。參照標準 : GB/T4789.3- ,GB/T4789.15- ,GB/T4789.2-內容:1 概述微生物限度檢查法系指非規定滅菌制劑及其原、 輔料受到微生 物污染程度的一種檢查方法 , 包括染菌量及控制菌的檢查。供試品一般按批號隨機抽樣 ; 抽樣量應為檢驗用量 （ 2 個以上 最小包裝單位 ） 的 3 倍量 （ 以備復檢 ） 。檢驗的全過程 , 均

2、應嚴格遵守無菌操作 , 嚴防再污染。2 儀器與用具恒溫恒濕培養箱、 生化培養箱、 恒溫水浴、 高壓蒸汽消毒鍋、 電熱恒溫干燥箱；試管、錐形瓶、量筒、培養皿（90mm）、刻 度吸管、 研缽 ; 托盤天平或電子天平、 鑷子、 剪刀、 酒精燈、 打火機、 編號筆、 75%酒精棉球 ； 拖鞋、 無菌衣、 褲、 帽、 口 罩。以上玻璃器皿、鑷子、 剪刀等洗凈、 晾干，160170 C干烤2h, 備用。所有滅菌物品存放于第一緩沖間 ， 不應超過 2 周即用畢。否則 ，應重新滅菌。3 培養基、 試液配制營養瓊脂培養基 （ 細菌用 ） 、 孟加拉紅培養基 （ 虎紅瓊脂培 養基 , 霉菌用 ） ,膽鹽乳糖培養基

3、 （ 即 BL, 用于大腸桿菌增菌培養 ） 、 4 甲基傘 形酮葡糖苷酸 （ MUG） 培養基 （ 用于大腸桿菌快速檢查 ） 、 麥康凱 瓊脂培養基 （ 即 MacC, 用于腸道菌分離培養 ） 、 蛋白胨水培養基 （ 供靛基質試驗用 ） 、 磷酸鹽葡萄糖胨水培養基 （ 供甲基紅及 VP 試驗用 ） 、 枸櫞酸鹽培養基 （ 供枸櫞酸鹽利用試驗用 ） ; 營養肉 湯培養基、 四硫磺酸鈉亮綠培養基 （ TTB, 沙門菌增菌用 ） 、 膽 鹽硫乳瓊脂 （ DHL） 或沙門、 志賀菌屬瓊脂 （ SS） 培養基 （ 用于沙 門菌分離培養 ） 、 麥康凱瓊脂或曙紅亞甲藍瓊脂培養基 （ 大腸桿 菌及沙門菌分離

4、培養用 ） 、 三糖鐵瓊脂 （ TSI） 斜面培養基 （ 腸道 菌初步鑒別用）的配制及滅菌方法參見中國藥典 一部附錄X皿C。0.1%2,3,5- 氯化三苯基四氮唑 （ TTC） 溶液 （ 供制備培養基用）、氫氧化鉀試液（供作V- P反應試劑）、a-萘酚乙醇溶 液（供作V P試劑）、靛基質試液。的配制及滅菌方法參見中國 藥典一部附錄X皿C。稀釋劑 : 0.9%無菌氯化鈉溶液、 無菌磷酸鹽緩沖液 （ PH7.2） 。4 操作過程4.1 試驗前的準備4.1.1 將所有已滅菌的培養皿、 錐形瓶、 研缽、 試管、 吸管、 量 筒、 稀釋劑及供試品等經過傳遞窗進入無菌室內 , 每次試驗 所用物品必須事先計

5、劃 , 準備足夠用量 , 避免操作中出入。 將全部包裝去掉 , 編號。4.1.2 開啟紫外燈 30 分鐘 （ 或臭氧發生器 1h） 和空氣過濾裝置 30 分鐘 , 進行空間滅菌處理。4.1.3 操作人員用肥皂洗手 , 關閉紫外線殺菌燈 （ 或臭氧發生器 ） , 進入緩沖間 , 換工作鞋。再用 0.1%苯扎溴銨 （ 新潔爾滅 ） 消 毒液洗手或乙醇棉球擦手 , 穿戴無菌衣、 帽、 口罩、 手套。4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手 , 再用乙醇棉球 （ 或碘伏棉球 ） 擦 拭供試品瓶、 盒、 袋等的開口處周圍 , 待干后用滅菌的手 術剪刀將供試品瓶、 盒、 袋啟封。啟封后先檢查包裝內側 及周圍有無

6、生霉、 長螨跡象 , 若經證實為生霉、 長螨即可 判為不合格 , 無須繼續檢驗。4.1.5 定期檢查無菌環境的空氣是否符合規定。4.2 操作4.2.1 細菌、 霉菌與酵母菌4.2.1.1 以無菌操作 , 稱取檢樣 25g（ml）, 加入含 225ml 滅菌水 的具玻塞錐形瓶中 , 振搖 30min, 即為 1: 10 稀釋液。4.2.1.2 用滅菌吸管吸取 1: 10 稀釋液 10ml, 注入滅菌試管中 , 另用 1ml 滅菌吸管重復吹吸 50 次, 使霉菌孢子充分散開。4.2.1.3 取 1 支 1ml 滅菌吸管吸取 1: 10 均勻供試液 1ml, 沿管 壁加入裝有 9ml 滅菌稀釋劑的試

7、管中 , 混勻即 1: 100 供 試液。以此類推 , 根據供試品污染程度 , 可稀釋至 1: 103 或 1: 104, 細菌選擇兩至三個稀釋度 , 霉菌選擇三個稀釋 度。4.2.1.4 在進行 10 倍遞增稀釋的同時 , 以該稀釋級吸管吸取每 級稀釋液各 1ml 置每個滅菌平皿中 , 每稀釋級注 2個平皿。 另取 1 支 1ml 吸管吸取稀釋劑各 1ml 注入 2 個平皿中 , 作 為陰性對照。421.5 將融化并冷至約 45 C的培養基注入上述各個平皿約15ml, 以順時針或反時針方向快速轉動平皿 （ 勿使培養基溢 出） 使供試液與培養基混勻 , 放置 , 待凝。4.2.1.6 將已凝固

8、的平板倒置于適宜溫度的培養箱中 , 培養。細菌于36C 士 1C培養48± 2小時，霉菌、 酵母菌于 2528 C培養，3天后開始觀察，共培養觀察5天。4.2.1.7 將平板置菌落計數器上或從平板的背面直接以肉眼用標記筆點計 , 以透視光襯以暗色背景 , 仔細觀察 , 計數。4.2.2 大腸桿菌取膽鹽乳糖培養基 3 份, 每份 100ml, 2 份分別加入規定量的 供試液 , 其中 1 份加入對照菌 50100個作陽性對照 , 第 3 份加入 與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養18 24 小時（ 必要可延至 48 小時 ） 。陰性對照應無菌生長。 取上述 3 份的培養物各 0.2m

9、l, 分別接種至5ml MUG培養基管內培養，分別于5小時與24小時時， 取未接種的MU（培養基管作本底對照，將各管置365nm紫外光下觀 察。陽性對照管呈現熒光，MUCTO性。供試液的MUGf呈現熒光，MUG陽性：無熒光，MUG陰性。然后加數滴靛基質試液于MU（管內，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。當陰性對照呈陰性，陽性對照正常生長，供試液膽鹽乳糖培養 基培養液澄明，并證明無菌生長，判未檢出大腸桿菌。供試液 MUG 陽性，靛基質陽性，判檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質陰性，判 未檢出大腸桿菌。如MUG日性、靛基質陰性，或MUG!性、靛基質陽性，均應 取供試液膽鹽乳糖培養基培養物劃線于

10、曙紅亞甲藍瓊脂平板或麥 康凱瓊脂平板，培養1824小時，如上述供試液培養物的分離平 板無菌落生長，判未檢出大腸桿菌。或有菌落生長，應挑選23可 疑菌落作靛基質試驗（I ）、甲基紅試驗（M）、乙酰甲基甲醇 生成試驗（V-P）、枸櫞酸鹽利用試驗（C）及革蘭染色、鏡檢，按F表判斷結果MUG I曙紅亞甲藍瓊脂IMVic結果+ +檢出大腸桿菌一 一未檢出大腸桿菌+ 無菌生長未檢出大腸桿菌+ 有菌生長+ 檢出大腸桿菌 +有菌生長+ + 檢出大腸桿菌注：如出現+或出現一+-,均應重新分離菌株，再作MUG-I和IMVic試驗。 革蘭氏陰性桿菌。4.2.3 沙門菌：取營養肉湯培養基 3份，每份100ml, 2份

11、分別加入規定量的供試液，其中1份加入對照菌液作陽性對照，第3份加入與供試液 等量的稀釋液作陰性對照。培養1824小時，陰性對照應無菌生長。取其余2份培養物各1 ml,分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養 基10 ml中，培養1824小時。分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂 （或 沙門、志賀菌屬瓊脂）培養基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍瓊脂） 培養基的平板上，培養1824小時或延至4048小時。當陽性對 照的平板呈現陽性菌落時，供試品的平板無菌落生長，或有菌落但不同于下表所列特征時，可判為未檢出沙門菌鋰傘甘 培養基菌落形態膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全黑色或無色沙門、志賀困屬瓊脂無色至淡紅色，

12、半透明或不透明，菌落中心有時帶黑褐色曙紅亞甲藍瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時為暗色如供試品平板生長的菌落特征有與上表所列形態特征相符或疑似者，均應挑選23個菌落分別接種于三糖鐵瓊脂培養基斜面 上,陽性對照同時接種該培養基，培養1824小時后，陽性對照 的斜面應為紅色，底層為黃色，硫化氫陽性，而供試品的疑似菌 斜面未見紅色、底層未見黃色，可判為未檢出沙門菌。否則，應繼續做靛基質試驗、 脲酶試驗、 賴氨酸脫羧酶試驗、動力檢查、血清凝集試驗。5注意事項5.1供試品在檢驗之前，應保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍 以防供試品內污染菌因保

13、存條件不妥引起致死 , 損傷或繁殖。 供試品在檢驗之前 , 應保持原包裝狀態 , 嚴禁開啟。包裝已開 啟的樣品不得作為供試品。5.2 除另有規定外 , 供試品制備成供試液后 , 應在均勻狀態取樣。 制成供試液后 , 應在 60 分鐘內注皿操作完畢。5.3 配制后的培養基應及時滅菌 , 避免細菌繁殖。 培養基不應有沉 淀 , 如發生沉淀 , 應趁熱過濾。5.4 制備妥的培養基應在冷暗處保存 , 放置時間不能過長 , 錐形 瓶的瓊脂培養基保存時間最長不能超過一個月 , 以免水分散 失染菌。5.5 勿用電爐直接融化瓊脂培養基 , 以免營養成分過度受熱而破 壞。5.6注皿時培養基應在 45 士 1 C ,咼于45 C時易造成細菌受損或致 死，低于45C時易凝固，因此使用