1、    人原代晶體上皮細胞bFGF多肽和 mRNA的表達        【摘要】目的為研究后發性白內障的發生機理，檢測生長中人晶體上皮細胞(human lens epithelial cells,HLECs)自身是否表達堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)。方法體外培養人晶體上皮細胞，用免疫細胞化學和原位核酸分子雜交的方法，檢測HLECs中bFGF多肽和其mRNA的表達。結果用免疫細胞化學和原位核酸分子雜交

2、方法，可檢測到生長中的人晶體上皮細胞自身表達堿性成纖維細胞生長因子。結論結合堿性成纖維細胞生長因子促進人晶體上皮細胞生長的作用，推測人晶體上皮細胞自身表達的bFGF，參與促進晶體上皮細胞生長增殖過程。【關鍵詞】晶體白內障上皮細胞生長因子Expression of bFGF in primary human lens epithelial cellsLiu Dongling,Wu Jingan. Department of Ophthalmology,First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034【Abstract】Objecti

3、veTo study the mechanism of after cataract formation and investigate the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in primary human lens epithelial cells(PHLECs). MethodsHuman lens epithelial cells were cultured in vitro, and the expression of bFGF was detected with immunohistochemistry and

4、 in situ hybridization.ResultsPHLECs express bFGF in protein and mRNA levels.ConclusionBased on bFGF promoting PHLEC growth and differentiation,the results suggest that bFGF from PHLECs take part in promoting such cell growth and differentiation. 【Key words】LensCataractEpithelial cellsGrowth factor后

5、發性白內障(簡稱后發障)因其高發生率和明顯影響白內障囊外摘除術的術后效果，已引起眼科學界廣泛關注。后發障形成的主要原因，是晶體囊袋內殘留上皮細胞生長、增殖、遷移和纖維分化，在后囊表面形成混濁薄膜。細胞生長增殖與多種因素有關，成纖維細胞生長因子在多種因素中起著重要作用。自70年代從牛腦垂體中分離純化出堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，以后又在同樣組織中分離純化了酸性成纖維細胞生長因子。此后，有學者確認了人房水中有bFGF的存在1；bFGF對人晶體上皮細胞有明顯的促進增殖和分化的作用2；人白內障晶體上皮細胞內有bFGF及其受體3；在后

6、發障形成中，晶體上皮細胞自身是否表達bFGF，對研究和預防后發障的形成有很重要意義。資料和方法一、人晶體上皮細胞的培養1.取材：眼球取自出生后至2歲死者15例(30只眼)，于死后12小時內無菌取材，0.25%氯霉素紗布包裹，置冰壺內送回實驗室。2.操作方法：將眼球浸泡于75%酒精30秒鐘后，用生理鹽水洗6次，移至超凈工作臺內；自角膜緣后2 mm處環行剪開鞏膜，分離去除玻璃體、角膜及虹膜。以D-Hanks液洗一次；在解剖顯微鏡下剪除晶體周圍懸韌帶，自晶體赤道后約1 mm環行剪開后囊膜，將前囊膜等分為四部分，揭下附著上皮細胞的前囊膜，接種于25 ml培養瓶內預置的蓋玻片上，置于37、5%CO2培養

7、箱中，待組織塊貼壁4小時后，加入含20%胎牛血清DMEM培養液2.5 ml，繼續培養1周后，換液一次，以后每3天換液一次。二、人原代晶體上皮細胞內bFGF多肽的檢測1.試劑：第一抗體為兔抗人bFGF特異性多克隆抗體，美國Sanata Cruz Biotechnology 公司產品。第二抗體為生物素化羊抗兔IgG，特異復合物為辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，以及DAB等其它試劑均購自北京中山生物制品公司。2.操作方法：采用免疫細胞化學SP法。取出原代培養匯合60%70%的細胞爬片，D-Hanks液洗3次，依次經過10%中性福馬林液固定30分鐘，分別以3%H2O2 30分鐘、110正常羊血清40分鐘

8、封閉內源性過氧化物酶；第一抗體(1100)結合，置濕盒內4過夜，第二抗體結合30分鐘，辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素結合30分鐘；新鮮配制DAB顯色液，顯色510分鐘，每一步驟間以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次3分鐘。蘇木素(pH 8.0)復染5分鐘，自來水沖洗3分鐘，脫水，透明，封片。3.對照組設置：陰性對照組分別以PBS代替第一抗體、第二抗體和辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，陽性對照為人血管平滑肌細胞爬片。4.生物顯微鏡觀察：陽性信號表現為細胞內黃色、淡黃色點網狀著色。三、人原代晶體上皮細胞內bFGF的mRNA檢測1.試劑：人bFGF的mRNA全長cDNA序列探針由軍事醫

9、學科學院提供。地高辛-DNA標記及檢測試劑盒為德國 Boehringer Mannheim公司產品。其它試劑嚴格按照RNA原位雜交要求配制，包括焦磷酸二乙酯(DEPC)水，0.3% Triton X-100，蛋白酶K，PBS，標準檸檬酸鹽-氯化鈉液(SSC)，硫酸葡聚糖，緩沖液，預雜交液(內含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、Denhart液、12 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、0.5 mg/ml酵母tRNA)，0.2 mol/L HCl，RNA酶(RNase)等。2.操作方法：將cDNA探針標記后，-20保存備用。取原代培養匯合60

10、%70%的細胞爬片，經4%多聚甲醛固定1015分鐘，0.3% Triton X-100洗片5分鐘，0.2mol/L HCl酸化5分鐘，蛋白酶K消化37，5分鐘，每步驟間用PBS洗3次。梯度酒精脫水，預雜交37，1小時；以1.5 ng/l探針濃度的雜交液滴于細胞爬片，43雜交17小時，順序以2×、1×、0.5×SSC洗片，120正常羊血清封閉20分鐘，15 000抗地高辛抗體結合，37，1小時；以新鮮配制硝基藍四氮唑(NBT)與5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)顯色液滴片，室溫下避光顯色2小時，自來水沖洗，番紅復染，自然干燥。3.對照組設置：分別用PBS代替

11、bFGF的cDNA探針以及RNase預處理細胞爬片作為陰性對照。4.生物顯微鏡觀察：bFGF的cDNA探針與細胞內相應mRNA雜交的陽性信號，表現為紫藍色顆粒，大部分陽性信號于胞漿內，部分信號與胞核重疊。結果一、bFGF免疫細胞化學檢測實驗組全部染片中，晶體上皮細胞內均可見陽性信號，染色部位位于細胞膜還是細胞漿，抑或兩部位均存在，細胞核內是否有所表達，此次免疫細胞化學檢測尚不能確定。陰性對照片內未見陽性信號(1，2)。1 原代培養人晶體上皮細胞bFGF免疫細胞化學，細胞內可見黃色、淡黃色點網壯陽性信號（免疫組化染色×600）2 免疫細胞化學陰性照組，細胞內無陽性信號，蘇木精復染（免疫

12、組化染色×400）二、bFGF的mRNA原位核酸分子雜交檢測實驗組全部細胞爬片中，可見細胞漿內bFGF的mRNA陽性雜交信號顆粒，陰性對照片細胞內未見陽性信號顆粒(3，4)。4 原位雜交陰性對照組，細胞內未見陰性信號，番紅復染（原位雜交染色×400）討論細胞分子生物學已經證實，細胞受損傷后引起的細胞增殖行為，是細胞對損傷的反應，在這一反應過程中有許多介質參與，多肽生長因子在這些介質中起著重要的作用。它們由細胞自分泌/旁分泌，或者釋放產生，作用于靶細胞，表現為強效的促進或抑制細胞增殖作用。促進晶體上皮細胞增殖的因子包括bFGF、EGF、IGF、TGF-以及IL-1等。生長因子

13、通過促使G0期和G1期細胞跨越限制點，進入增殖狀態，其中bFGF被認為是誘導這一過程的啟動因子，在時間和效應上與其它因子連續、協同作用，使細胞完成有絲分裂。以往有關晶體上皮細胞bFGF的研究進行了一些工作。Namiki4將家兔分成晶體超聲乳化吸出術組和聯合人工晶體植入術組，手術前后用ELISA方法檢測房水中bFGF含量變化，結果兩組間無差異。人工晶體植入組房水bFGF含量，術前在10 pg/ml以下，術后第1天增至300±280 pg/ml，術后1周達高峰，為450 pg/ml，術后8周仍維持在100200 pg/ml。Sculz等5用Northern blot法檢測到牛晶體上皮細胞

14、中有bFGF的表達。Lovicu等6用免疫細胞化學的方法檢測到大鼠的新生鼠、乳鼠及成年鼠晶體前囊膜內存在bFGF。McAvoy等7向大鼠晶體上皮細胞培養液中加入不同濃度bFGF，呈現不同的作用，最大半數有效量在150 pg/ml、30 ng/ml和40 ng/ml時，分別起促增殖、促遷移和促分化作用。曾有報道培養人晶體上皮細胞，用ELISA法動態檢測培養液中bFGF含量變化，結果培養1天為470 pg/ml，2天為310 pg/ml，1周為269 pg/ml。Nishi等8培養人晶體上皮細胞，加入bFGF后，用H3-TdR摻入法計數其摻入量，結果顯示H3-TdR的摻入量在實驗組明顯高于對照組，

15、表明bFGF對晶體上皮細胞起促進增殖的作用。 Reddy等2以含10 ng/ml bFGF的培養液培養人晶體上皮細胞，觀察對上皮細胞的作用，同時還用免疫電鏡的方法觀察bFGF受體數目的變化，結果顯示bFGF受體數目有變化，以及bFGF對晶體上皮細胞起促進增殖和分化作用。隨著培養時間的延長，bFGF受體數目減少，其促增殖作用也明顯減弱。Majima等3報道，用免疫細胞化學法檢測到原位人白內障晶體上皮細胞有bFGF及其受體存在。基于bFGF對晶體上皮細胞促增殖作用比較明顯，為深入探討它在人類晶體上皮細胞生長過程中有無自身bFGF表達，本實驗在多肽和mRNA水平，以免疫細胞化學和原位核酸分子雜交方法

16、，檢測原代生長中人晶體上皮細胞bFGF表達情況。免疫細胞化學的方法是根據抗原抗體特異結合的原理，利用已知抗體檢測組織細胞中特異蛋白質的方法。SP法在免疫細胞化學方法中是一種較新的、特異性強且穩定可靠的方法，其結果可以顯示有無被檢多肽或蛋白質的存在。原位核酸分子雜交的方法是根據核酸分子堿基互補結合的原理，用已知核酸片段探測細胞中相應核酸的存在。地高辛-DNA標記檢測法，具有高度靈敏性和特異性，安全穩定，可避免內源性干擾。以上兩種方法結合，在蛋白(多肽)和mRNA水平檢測，可以從兩個不同角度說明靶物質的表達與否。本實驗應用特異性兔抗人bFGF多克隆抗體和人bFGF全長序列cDNA探針，檢測生長中人

17、晶體上皮細胞bFGF多肽及其mRNA的表達，結果顯示兩者均有表達。與1997年較新報道9用RT-PCR法所做的結果相吻合。根據其他研究者的報告和本實驗結果，我們認為在人晶體上皮細胞生長過程中，其自身仍表達堿性成纖維細胞生長因子，后者亦參與啟動晶體上皮細胞生長、增殖及分化。如進一步實驗，可以從抑制堿性成纖維細胞生長因子的表達，對晶體上皮細胞增殖的影響中觀察到相應的結果。參考文獻1Tripathi RC,Borisuth NSC,Tripathi BJ.Detection, quantification, and significance of basic fibroblast growth fa

18、ctor in the aqueous humor of man,cat,dog and pig.Exp Eye Res,1992,54:447-454.2Reddy VN,Ibaraki N ,Lin LR.Changes of fiber differentiation in human lens epithelial cells exposed to growth factors in several subcultures.Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36(Suppl):S260.3Majima K,Kousaka M.The existence of

19、 epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor in human lens epithelial cells.J Jpn Ophthalmol Soc,1995,99:81-86. 4Namiki M.Quantification of basic fibroblast growth factor (bFGF)and transforming growth factor (TGF) in rabbit aqueous humor after intraocular lens implantation.J Jpn Ophth

20、almol, 1994,98:334-339.5Schulz MW,Chamberlain CG,de Iough RU,et al.Acid and basic FGF in ocular media and lens implications for lens polarity and growth patterns.Development ,1993 ,118: 117-126.6Lovicu FJ,McAvoy JW.Localization of acid fibroblast growth factor,basic fibroblast growth factor and heparan sulphate proteoglycan in rat lens:implications for l