1、    內源性接觸激活系統對單核細胞粘附的影響        摘要目的：研究接觸激活系統對尿激酶型纖溶酶原激活物（U-PA)引起單核細胞粘附的影響及它們之間的相互關系。方法：3H-TdR標記的U937細胞培養于24孔板，在高分子激肽原(HK/HKa)，激肽釋放酶(kallikrein,KK),因子(factor )和纖溶酶原(plasminogen)的作用下，觀察U937細胞的粘附情況。結果：Hka、KK抑制U-PA引起的單核細胞粘附，因子X和Plasminogen促進單核細

2、胞粘附。結論：接觸激活系統是單核細胞粘附的重要調節因素。主題詞尿激酶； 單核細胞； 細胞粘附中分類號Q461文獻標識碼 A文章編號1000-4718(2000)03-0233-04 Effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activatorLIU Jian-xia, ZUO Jian-ling, QIN Lei, QIAN Hai-xin(The First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 2

3、15006, China)LIU Jian-ning(Vascular ReserchLaboratory, Deaconess Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02215, USA)Abstract AIM:To study the effect of contact system in monocyte adhesion induced by urokinase-type plasminogen activator (U-PA). METHODS:U937 cells were labeled with H t

4、hymidine in the culture medium, test reagents were added into the cell suspension in 24-well plates. The counts*min-1 were counted in a liquid scintillation counter. RESULTS:U-PA-induced monocyte adhesion was inhibited by high-molecular-weight kininogen and kallikrein, and promoted by factor and pla

5、sminogen. CONCLUSION:these contact system proteins may be important modulators of U-PA-induced monocyte adhesion, a process which is involved in many pathophysiological events.MeSH Urokinase; Monocytes; Cell adhesion單核細胞粘附參與許多病理生理過程如創口愈合、感染、腫瘤浸潤和轉移等。尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator,U

6、-PA）在單核細胞粘附中起著重要作用,它和U-PA受體結合后，通過cAMP介導的信號傳遞，引起細胞粘附，從而引發一系列病理生理反應。由于U-PA和內源性接觸激活系統中的3種因子激肽釋放酶（kallikrein,KK）、高分子量激肽原（high-molecular-weight kininogen,HK/HKa）、十二因子（）及纖溶酶原（plasminogen）與U-PA在功能上密切相關，故本文探討4種因子對U-PA引起單核細胞粘附的影響。材料和方法一、試劑和細胞株人激肽釋放酶、HK(HKa)和(a)購于Enzyme Research Laboratories(美國)；U-PA(MW 54 KD

7、a)購于Green cross（日本）；RPMI 1640購于Gibco BRL(美國)；氟磷酸二異丙酯（diisopropyl fluorophosphate,DFP)及胎牛血清（fetal calf serum,FCS）購于Sigma(美國),單核細胞株U937購于Type Culture Collection(美國)。酶的底物S2444和S2302購于Kabi(美國)。二、U-PA、激肽釋放酶、a活性滅活在室溫下,U-PA、激肽釋放酶、a分別在DFP(5 mmol/L)中孵育2 h,充分透析后用S2444檢測U-PA的酶活性,S2302檢測激肽釋放酶和a的酶活性，經DFP處理后，它們的酶

8、活性均消失。三、細胞培養和細胞粘附測定單核細胞株U937細胞生長于RPMI 1640培養基中,含10% FCS;青霉素(100 U/mL),鏈霉素(100g/mL),二性霉素B(0.25g/mL),在37,5% CO2培養。細胞粘附測定按WALTG1方法略加改進。U937細胞(1×106/mL)和3H-TdR(3.7×10Bq/mL)共同培養24 h,離心收集細胞(350×g,4 min,4),用無血清RPMI 1640洗滌3次，用含10% FCS的RPMI 1640重懸細胞(1×106/mL)，加入被測試劑后，在24孔板中（300L/孔）37,5% C

9、O2,培養17h，去上清，用PBS洗滌3次，殘留的細胞即為粘附在24孔板上的單核細胞。每孔加入1 mL裂解液(10% glycerol,0.2% sodium dodecyl sulfate,0.2% tritonX-100),每1 mL裂解物加入10 mL液閃液（formula-989 high flash-point cocktail),用液閃儀測定Counts.min-1,單核細胞粘附的程度用每1000個細胞所對應的Counts.min-1值表示。結果一、U-PA增強U937細胞的粘附作用按方法所述，U-PA的濃度選擇05 nmol/L和U937細胞共同培養，發現細胞的粘附作用隨U-PA

10、的濃度增高而增強。未發現對照組細胞粘附現象發生（見1)。用DFP預處理滅活U-PA的酶活性后，U-PA的這種促粘附作用不受影響（見2B）。二、HK抑制U-PA引起的細胞粘附HK和HKa是血清中的抗粘附蛋白，其中HKa的作用更強。U937細胞培養在含10% FCS和10 nmol/L U-PA的培養基中，再加人HK（含10% Hka），HK的濃度由0 nmol/L遞增至10 nmol/L。1顯示：HKa可抑制U-PA引起的細胞粘附，HKa對細胞的抗粘附作用隨著HKa濃度的增高而加強(見1）。三、激肽釋放酶對U-PA引起細胞粘附的影響由于HKa的抗粘附作用明顯強于HK，而激肽釋放酶催化HK轉化為H

11、Ka，因此我們也探討激肽釋放酶在細胞粘附中的作用。U937細胞培養在含2 nmol/L的U-PA的培養基中，激肽釋放酶的濃度范圍0640nmol/L，結果顯示：低濃度的激肽釋放酶（200nmol/L）能輕度增強細胞粘附作用。而高濃度激肽釋放酶（400nmol/L），則起抑制作用（見2A）。用DFP預處理使激肽釋放酶的酶活性被滅活，激肽釋放酶抑制作用即消失（見2B）。     Fig1U-PA induced monocyte U937 adhesion and the anti-adhesion effect of Hka3H-labeld U937 c

12、ells at 1×106/mL were incubated with U-PA (010 nmol/L) in the absence or the presence of Hka in 24-well plates. The quantity of the adherent cells were measured and expressed in counts.min-1     Fig 2Effect of KK on U-PA-induced monocyte U937 adhesionA.3H-labeled U937 cells

13、were cultured in a medium containing 2 nmol/L U-PA and KK(0640 nmol/L). B.3H-labeled U937 cells were incubated with (a) control , (b)1nmol/LU-PA, (c)1nmol/L DFP-U-PA, (d)1nmol/L U-PA and 400nmol/L KK, (e)1nmol/L U-PA and 400 nmol/L DFP-KK. The quantity of the adherent cells were expressed in counts.

14、min-1四、因子和纖溶酶原在細胞粘附中的作用因子和纖溶酶原具有促單核細胞粘附作用，當因子和纖溶酶原存在時，U-PA促進單核細胞粘附作用明顯加強，預先用DFP處理，將其酶活性滅活，不影響其調節作用（見3）。     Fig 3Effects of and plasminogen on U-PA induced monocyte U937 cell adhesion3討論已知纖溶和凝血系統之間有密切的關系，U-PA和內源性接觸激活系統各因子（a,HKa,KK）相互作用，調節凝血和纖溶反應。近年的研究表明，U-PA可誘導單核細胞粘附，該反應參與多種病理生理反

15、應。內源性接觸激活系統對U-PA的這種作用有何影響，尚未見報道。我們的實驗表明，在體外實驗中，內源性接觸激活系統3因子（高分子激肽原HK/HKa、激肽釋放酶KK、十二因子）和纖溶酶原是調節U-PA誘導的單核細胞粘附的重要因素。HK/HKa及激肽釋放酶可下調U-PA誘導的單核細胞粘附，及纖溶酶原可上調U-PA誘導的單核細胞粘附。Waltz等1報道，U-PA和U-PA受體結合后，通過cAMP介導的信號傳導，引起單核細胞粘附，從而觸發人體一系列生理和病理反應。在實驗中，U-PA經DFP預處理去除酶活性后，其作用不受影響，由此推測，U-PA的作用與酶活性無關。有學者報導，U-PA存在EFG區域，該區域

16、與U-PA受體結合，激發一系列反應2。在我們實驗中，U-PA的濃度1 nmol/L,比人體血漿的濃度高10倍以上，因為在某些病理狀態下，如腫瘤轉移，炎癥，風濕病，細胞表面U-PA和U-PA受體過表達，產生很高的局部濃度3，4。HK/HKa、激肽釋放酶與U-PA及其受體之間存在著復雜的相互作用，Colman等5報道，U-PA受體有3個結合位點，HKa和其中2個結合，影響U-PA和其受體的結合，從而抑制了U-PA的促粘附作用。激肽釋放酶可以激活單鏈U-PA轉變為雙鏈U-PA6，后者活性更強（約100倍），它和PAI-1快速結合，被細胞吞飲而滅活7。高濃度激肽釋放酶促進HKHKa，抑制細胞粘附。在實

17、驗中，激肽釋放酶的調節作用較為復雜，在低濃度時，表現為輕度的促細胞粘附作用，我們認為可能與其將單鏈U-PA轉變為雙鏈有關。在高濃度時（400nmol/L以上），它表現為抑制作用為主。我們推測激肽釋放酶下調U-PA的粘附作用通過以下2個途徑：KK促進牛血清HKHKa；促進單鏈U-PA雙鏈U-PA,后者和PAI-1結合而滅活。由于血漿中激肽釋放酶的濃度為500600nmol/L，因此，激肽釋放酶在體內主要表現為抑制作用。用DFP預處理激肽釋放酶，其酶活性消失后，對U-PA的調節作用也隨之消失，所以激肽釋放酶的作用和酶活性有關。、纖溶酶原和U-PA之間也有著復雜的相互作用，a可以促使激肽釋放酶前體轉

18、變為激肽釋放酶，后者可使HKHKa，單鏈U-PA雙鏈U-PA,雙鏈U-PA可激活纖溶酶原，從而引發一系列瀑布反應。我們用DFP滅活a的活性，并不影響a的調節作用。可見，a的作用和酶活性無關。a和纖溶酶原上調U-PA誘導單核細胞粘附，其作用機制尚不清楚，有待進一步研究。總之，接觸激活系統和U-PA在體內廣泛存在，并且相互影響，在U-PA引起單核細胞粘附過程中，接觸激活系統是重要的調節因素。劉建夏（蘇州醫學院附屬第一醫院，江蘇 蘇州 215006）左劍玲（蘇州醫學院附屬第一醫院，江蘇 蘇州 215006）秦磊（蘇州醫學院附屬第一醫院，江蘇 蘇州 215006）錢海鑫（蘇州醫學院附屬第一醫院，江蘇

19、蘇州 215006）LIU Jian-ning（Vascular Reserch Laboratory, Deaconess Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02215, USA）參考文獻1Waltz DA, Sailor LZ, Chapman HA, et al. Cytokines induce urokinase-depend adhesion of human myeloid cells. A regulatory role for plasminogen activator inhibitors J.

20、J Clin Invest, 1993, 91: 15411552.2Wei Y,Waltz DA, Rao N, et al. Identification of the urokinase receptor as an adhesion receptor for vitronectin J. J Biol Chem, 1994, 269: 3238032388.3Blasi F. Urokinase and urokinase receptor: a paracrine/autocrine system regulating cell migration and invasiveness J. Bioessays,1993， 15: 105111.4Jankun J, Merrick HW,Goldblatt PJ. Expression and locali