1、嗜酸細胞凋亡在激素抵抗型哮喘中的意義【摘要】目的觀察激素抵抗型（SR）哮喘是否存在嗜酸細胞（EOS）凋亡功能的異常及促炎癥細胞因子白細胞介素5（IL-5）和粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）的調節作用。方法分離SR（15例）、激素敏感型（SS，30例）兩組哮喘患者外周血單個核細胞（PBMCs）及EOS，體外培養后測定：（1）PBMCs在糖皮質激素處理前、后分泌細胞因子的能力；（2）自發的或糖皮質激素誘導的或用PBMCs培養上液處理后的EOS凋亡率及Fas抗原表達率。結果（1） 糖皮質激素處理前SS組與SR組患者PBMCs分泌IL-5水平（g/L）分別為19668、23598；GM-CSF

2、分泌水平（g/L）SS組和SR組患者分別為325110、356131，兩組比較差異均無顯著性（P0.05）。地塞米松處理后與處理前比較，SR組IL-5水平為（21075）g/L，差異有顯著性（P0.01）；SS組IL-5為（14762） g/L，差異有顯著性（P0.01），GM-CSF為（27097）g/L，差異有顯著性（P0.05）。（2）SS組與SR組EOS在體外培養時均發生不同程度的凋亡。EOS基礎凋亡率SS組為（6721）%，SR組為（3317）%，兩組與誘導前比較差異有顯著性（P0.001）。Fas抗原表達率SS組為（5423）%，SR組為（2715）%，兩組比較差異有顯著性（P0.

3、001）。地塞米松誘導后，SS組凋亡率為（8920）%，與誘導前比較差異有顯著性（P0.1）。SR組EOS誘導凋亡率和Fas表達率分別為（4118）%、（3513）%，與誘導前比較差異無顯著性（P均0.1）。同一患者的PBMCs培養上液可對抗地塞米松誘導EOS凋亡的作用，以SR組更為明顯。結論SR患者的EOS存在自身凋亡功能的缺陷并對激素誘導凋亡作用不敏感，同時Th2細胞分泌促炎癥細胞因子的活性不能為激素所抑制，是EOS凋亡不足的另一原因。【關鍵詞】哮喘；嗜酸細胞凋亡；激素抵抗Effect of eosinophil apoptosis on glucocorticoid-resistant

4、asthmaLIU Chuntao, WANG Zengli, XIE Min, et al.(Division of Respiratory Medicine, The First Hospital of West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the function of eosinophil apoptosis and regulation of glucocortico steroids on IL-5 and GM-CSF e

5、xpression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in glucocorticoid-resistant asthmatic patients. MethodsEosinophils (EOS) and PBMCs isolated from glucocorticoid-sensitive (SS, 15 cases) and resistant (SR, 30 cases) asthmatic subjects were cultured and treated with dexamethasone (DXM) in vitro

6、. Concentrations of IL-5 and GM-CSF were determined by ELISA in the supernatants recovered in sham and DXM treated cells. The rates of EOS apoptosis and Fas antigen expression were documented via flow cytometer in sham, DXM treated and PBMC supernatant treated groups respectively. ResultsThere were

7、no statistical significant differences of the concentrations of both IL-5 and GM-CSF in sham cultured PBMC supernatants between SS and SR groups (19668) g/L vs. (23598 ) g/L IL-5 (P0.05), (325110) g/L vs. (356131) g/L GM-CSF (P0.05); SS versus SR groups, respectively. There were statistically signif

8、icant decreases in both IL-5 and GM-CSF after DXM exposure in SS group (19668) g/L vs. (14762) g/L IL-5 (P0.01); (325110) g/L vs.(27097) g/L GM-CSF (P0.01). In contrast, there were no significant differences in both IL-5 and GM-CSF after DXM exposure in SR group. Baseline rates of both EOS apoptosis

9、 and Fas antigen expression were statistically significant different between SS and SR groups (6721)% vs. (3317)% the rate of EOS apoptosis (P0.001); (5423)% vs.(2715)% the rate of Fas antigen expression (P0.001), SS versus SR groups, respectively. A dramatic increase in EOS apoptosis after DXM expo

10、sure was observed in SS group (6721)% vs. (8920)% (P90%，臺盼藍拒染法細胞活力95。細胞濃度調整為1105/ml。2.PBMC體外培養及細胞因子檢測：PBMC以無血清RPMI 1640培養液洗滌，制成細胞懸液，置96孔培養板，每份2孔，每孔細胞數1105 ml，加入植物血凝素（PHA）終濃度為50 mg/L，其中1孔加入地塞米松（DXM，美國Sigma公司），終濃度為10-6mol/L，孵育24 h（37 ，5 CO2），吸取上液，以IL-5、GM-CSF ELISA試劑盒測定IL-5和GM-CSF濃度。3.EOS體外培養：EOS以無血清R

11、PMI 1640液洗滌。制成細胞懸液，加入96孔培養板中，細胞濃度為每孔104 ml，每一受試者分為3孔，其中2孔分別加入：（1）DXM，終濃度為10-6mol/L；（2）DXM（10-6mol/L）+同一受試者PBMC培養上液10 l。體外孵育72 h（條件同上）。4.EOS凋亡率與Fas抗原檢測：取70 孔徑尼龍篩網過濾孵育EOS，濾過液低速離心1 000 r/min，3 min，去上清；調整細胞濃度為104/ml，加入CD95-FITC10U，按操作程序在室溫避光孵育15 min后，加入5 ml PBS緩沖液離心洗滌，去上清。細胞固定打孔；經以上步驟處理的細胞轉入流式上機試管，加入1 m

12、l PI工作液作DNA染色，15 min后上機檢測；由流式細胞儀專用數據分析軟件（Elitee）進行數據處理。凋亡細胞與CD95（Fas）陽性細胞分別以占總細胞數的百分數表示。統計學處理：所有數據采用s表示，用SPSS軟件進行t檢驗分析。結果一、 SS組與SR組哮喘患者PBMC產生細胞因子水平的差異我們的試驗顯示，哮喘患者PBMC可在體外培養時分泌兩種主要的促炎癥細胞因子IL-5和GM-CSF，其基礎分泌水平SR組較SS組患者略高，但二者比較差異無顯著性（P0.05）。預先在培養液中加入DXM，對SR組患者的PBMC產生細胞因子有輕度影響，與基礎水平比較差異無顯著性（P0.05），但可顯著地使

13、SS組PBMC產生的細胞因子濃度明顯下降，提示激素抑制PBMC的作用在SS型哮喘較SR型哮喘敏感（表1）。表1各組PBMC培養上液細胞因子濃度（s）組別例數IL-5（g/L）P值GM-CSF（g/L）P值SS組3019668325110SSDXM組30147620.01*270970.05*2561310.05*SRDXM組15210750.1*3121470.05*注： 與自發分泌比較*P0.05 二、EOS凋亡與激素抵抗的關系體外培養72 h后，SS組與SR組患者的EOS均發生不同程度的凋亡。SS組表現較高的基礎凋亡率為6721和Fas抗原表達率為5423，與SR組（3317，2715）比

14、較差異有顯著性（P均0.001），若用DXM誘導，凋亡率進一步升高（8920，與自發凋亡率比較（P0.1）。SR組不僅EOS自發凋亡率和Fas表達率較低，且用地塞米松誘導后凋亡的水平變化較小（4118，3513），與誘導前比較差異無顯著性（P均0.1）。加入同一個體的PBMC培養上液與地塞米松共同培養，可使凋亡率和Fas表達率降低，顯示PBMC培養上液有對抗地塞米松誘導EOS凋亡的作用，但僅SS組Fas表達率和SR組凋亡率的降低與單獨用地塞米松比較差異有顯著性（P0.05及0.001，表2）。討論目前已經明確EOS是參與哮喘氣道炎癥最主要的效應細胞， EOS募集入肺并釋放損傷性介質是氣道炎癥的

15、中心環節。近年發現EOS可在氣道局部發生凋亡,凋亡時形成的凋亡小體被巨噬細胞吞噬，無內容物外溢，不觸發炎癥反應，因此EOS凋亡是氣道炎癥消退的有效途徑，而局部凋亡-抗調亡機制失衡是氣道炎癥發展、持續的重要因素。一般認為哮喘氣道炎癥時凋亡機制異常可能表現為凋亡不足或凋亡延遲。如錢桂生等4報道，哮喘組EOS凋亡率為（2.11.3）%，而對照組為（10.13.4）%，并推測凋亡抑制基因Bcl-2和白細胞介素1 轉化酶（ICE）過度表達可能是哮喘氣道EOS凋亡不足的原因之一。有證據表明，GC抑制氣道炎癥的作用部分來自其誘導EOS及其它炎性細胞凋亡的活性。Wolley等5在1996年首次證實，GC治療可

16、使哮喘患者臨床癥狀改善，氣道中EOS明顯減少，凋亡率明顯增加，并被巨噬細胞所吞噬。GC通過誘導氣道上皮細胞產生Fas而誘導EOS凋亡。近期國內亦有數項研究涉及GC對EOS凋亡的影響，如歐陽能太等6發現，DXM處理后的哮喘豚鼠，其氣道中淋巴細胞（CD+4）減少，原因之一在于淋巴細胞凋亡增加。周向東等7則報道，在體外培養中，哮喘患者外周血分離的多形核白細胞(PMN)、EOS、T淋巴細胞（TLC）凋亡延遲，顯示處于凋亡抑制狀態，而加入GC于培養基中，可顯著增加EOS和TLC的凋亡，但卻抑制PMN的凋亡，顯示GC對肺部炎性效應細胞凋亡作用有一定異質性。GC對EOS凋亡的影響可能通過兩個途徑：（1）阻斷

17、Th2 CK基因的表達，使支持EOS存活的IL-3、IL-5、GM-CSF產生減少；（2）可能參與凋亡基因與受體的調節，如加強抗Fas單抗活性，活化EOS表面Fas等。表2各組EOS凋亡率與Fas表達水平（%，s）組別例數自發DXM誘導DXM+PBMC上液凋亡率Fas表達率凋亡率Fas表達率凋亡率Fas表達率SS組30672154238920601772284821SR組15331727154118535132712189激素抵抗型哮喘屬于哮喘的一種少見的特殊類型，關于其診斷標準目前尚未取得一致意見，通常的定義為在保證依從性前提下，規則口服潑尼松每天40 mg，療程2周，其FEV1占預計值%（

18、75%）的改善15%1。但亦有作者提出異議，認為每天40 mg的劑量過大，對患者有一定的危險性，對中國人而言劑量尤嫌偏大。故國內孫永昌等8提出的修訂標準所采用的給藥方案為口服潑尼松每天20 mg，療程7 d，我們亦采用此一方案。現有資料顯示，哮喘時存在EOS凋亡延遲，而糖皮質激素的抗炎平喘作用可能與其誘導EOS及淋巴細胞凋亡有關，但對于哮喘中的激素抵抗現象是否與凋亡有關，目前尚缺乏重視。我們的試驗證實，SS和SR組患者的EOS均可在體外培養時自發地凋亡并表達凋亡基因相關產物Fas抗原，而SR組患者的凋亡水平明顯高于SS組，提示激素抵抗時存在EOS凋亡功能的低下。激素在體外培養時可顯著誘導SS組

19、患者的EOS凋亡，而對SR組患者EOS凋亡水平影響甚微，進一步說明激素抵抗的機制可能涉及EOS對激素誘導凋亡的不敏感。分析其原因可能有：（1）凋亡受到相關基因的控制，Fas/APO-1是主要的凋亡促進基因，編碼的膜蛋白Fas/APO-1抗原激活后可誘發細胞凋亡，而Bcl-2據認為是主要的凋亡抑制基因。正常或哮喘時氣道與外周血EOS表面均可表達Fas/APO-1（CD95）。Druithe等9發現，EOS在培養后4872 h 后，EOS表面更易于測出CD95，但以培養612 h的EOS對抗Fas誘導的凋亡更為敏感。我們的試驗顯示，SR組自發的與激素誘導的EOS表面Fas抗原表達率均低于SS組，提

20、示激素抵抗時EOS凋亡不足與Fas基因表達缺陷有關。因未測定Bcl-2抗原，故不能確定是否有凋亡抑制基因的異常；（2）炎癥局部產生的細胞因子或其它介質，在調控EOS凋亡中亦發揮重要的作用。Th2型CK包括IL-5、GM-CSF、IL-3不僅對EOS有趨化與功能活化作用，大量實驗證明，亦是主要的EOS存活維持因子，即主要的抗凋亡因子。卵蛋白(OVA)致喘小鼠的EOS在體外培養時，若無IL-5或GM-CSF支持，在72 h幾乎全部凋亡，培養液中IL-3，IL-5或GM-CSF與維持EOS活力（抗凋亡）效應之間存在濃度依賴關系10。我們發現，糖皮質激素可在體外培養時顯著抑制SS患者的PBMC（以淋巴

21、細胞為主）在體外培養時釋放IL-5和GM-CSF的能力，分析其機制除與激素直接抑制細胞因子的合成有關以外，亦可能與其誘導淋巴細胞凋亡有關。這一結果與孫永昌等8所觀察到激素對SR患者T細胞增殖的抑制作用顯著低于SS患者的現象吻合。激素對SR組患者的PBMC在體外分泌促炎癥細胞因子的活性影響較小，反映出較高水平的Th2細胞來源的細胞因子對EOS的生長支持作用，是EOS凋亡不足的另一原因。同一個體的PBMC培養上液（含有上述細胞因子）可使EOS的凋亡率更為低下，并加強對激素誘導凋亡的抵抗，進一步反映出促炎癥細胞因子對EOS凋亡的影響。從我們的試驗可以得出如下結論：（1）糖皮質激素抵抗患者的EOS存在

22、自身凋亡功能的缺陷；（2）此類患者同時存在Th2細胞分泌促炎癥細胞因子的活性不能為激素所抑制，是EOS凋亡不足的另一原因。進一步研究激素與細胞凋亡的關系，有助于深入了解激素抵抗這一特殊的臨床現象，并為臨床治療提供指導，或作為臨床診斷SR型哮喘的輔助指標。已發現某些藥物如茶堿、大環內脂類抗生素與環孢素A可誘導EOS凋亡，且環孢素A對某些糖皮質激素抵抗型哮喘亦有較好療效，故增加EOS凋亡的途徑，可能是針對激素抵抗型哮喘的可行的選擇。 基金項目：國家自然科學基金資助項目（39570329）作者單位：劉春濤(610041 成都，華西醫科大學附屬第一醫院呼吸內科)王曾禮(610041 成都，華西醫科大學附屬第一醫院呼吸內科)謝敏(610041 成都，華西醫科大學附屬第一醫院呼吸內科)袁益明(610041 成都，華西醫科大學附屬第一醫院呼吸內科)參考文獻1.Stephen JL, Tak HL. Glucocorticoid-resistant asthma. Stephen T Holgate，ed. Difficult asthma. London: Martin Dunitz, 1999. 389.2.中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組. 支氣管哮喘防治指南（支氣管哮喘定義、診斷、治療、療效判定標準及教育和管理方案）.中華結核和呼吸雜志, 1997,