1、生物與化學工程學院專業實驗報告題目 黑曲霉產檸檬酸發酵工藝條件的優化 學生姓名： 王一 專業班級： 生物工程2012010302班 學 號： 1201815076 課程名稱： 發酵生產技術綜合實驗 指導教師： 李信義 日 期： 2013.6.2-2013.6.29 黑曲霉發酵產檸檬酸工藝條件的優化摘要：檸檬酸是生物體主要代謝產物之一，在自然界中分布很廣，主要存在于檸檬、柑橘、菠蘿、梅、李、梨、桃、無花果等果實中，尤以未成熟者含量居多。檸檬酸又名枸櫞酸,分子式為C6H8O7 ,物理性質：無色透明或半透明晶體，或粒狀、微粒狀粉末，有強烈酸味，稍有澀味；極易溶于水，溶解度隨溫度的升高而增大。化學性質

2、：從結構上講檸檬酸是一種三羧酸類化合物，加熱至175°C時它會分解產生二氧化碳和水，剩余一些白色晶體。檸檬酸是一種較強的有機酸，有3個H+ 可以電離；加熱可以分解成多種產物，與酸、堿、甘油等發生反應。 同時檸檬酸，是重要的工業原料。可從植物原料中提取，也可由糖進行發酵制得。本實驗研究了不同接種量、溫度、PH、發酵有效體積、溶解氧對黑曲霉產檸檬酸發酵的效率，已選出最適宜黑曲霉發酵產酸的條件。關鍵詞：黑曲霉 檸檬酸 發酵條件 優化Abstract：Citric acid is one of the main metabolites of the organism, is widely d

3、istributed in nature, mainly in lemon, orange, pineapple, peach, pear, plum, fig fruit, especially in the most immature content. citric acid or citric acid. Molecular formula is,physical properties: colorless transparent or translucent crystal, or granular, granular powder, although have strong sour

4、, slightly astringent. Easily soluble in water, the solubility increases with the increasing of temperature. Chemical properties: citric acid from the structure is a kind of three carboxylic acid compounds, heated to 175°C it will decompose to produce carbon dioxide and water, the remaining num

5、ber of white crystal. Citric acid is a strong organic acid, 3 ionization; heating can be decomposed into a variety of products, reacts with the acid, alkali, glycerin etc.同時檸檬酸，是重要的工業原料。可從植物原料中提取，也可由糖進行發酵制得。實驗研究了不同硫酸銨濃度分別對黑曲霉搖瓶發酵和實罐發酵生產檸檬酸的影響。在菌濃度、發酵過程接種量、培養時間、溫度在發酵過程中的變化幾個方面對實罐和搖瓶發酵進行了相關比較。 At the

6、same time, citric acid, is an important industrial raw materials. It can be extracted from plant materials, can also be prepared by sugar fermentation. The experimental study of different inoculation quantity, temperature, PH, dissolved oxygen, fermentation volume on the efficiency of citric acid fe

7、rmentation of Aspergillus niter, has to choose the most suitable fermentation conditions of Aspergillus niter.Keywords：Aspergillus niter Citric acid Fermentation Conditions Optimization 目 錄1.綜述12.實驗儀器藥品材料及分析方法12.1實驗設備12.2實驗試劑及材料12.3菌株12.4分析方法13.實驗設計23.1培養基的制備23.2斜面種子和液體種子的制備23.3溫度對檸檬酸發酵的影響23.4溶解氧對檸檬

8、酸發酵的影響23.5接種量對產檸檬酸發酵的影響23.6發酵液有效體積對產檸檬酸發酵的影響33.7初始PH值對產檸檬酸發酵的影響3 3.8檸檬酸的測定34.結果與分析34.1不同初始PH的檸檬酸產率34.2不同接種量的檸檬酸產率44.3不同溫度的產檸檬酸率54.4不同發酵液有效體積的產檸檬酸率64.5不同溶氧的產檸檬酸率7 4.6正交實驗及結果75.結論與展望8 5.1結論8 5.2展望86.參考文獻87.感受91.綜述 檸檬酸（citric acid）又名枸櫞酸。檸檬酸是生物有機體三羧酸循環的中間代謝產物之一，廣泛存在于自然界各種生物體中，特別是在檸檬、柑橘、菠蘿、李、梅、桃等果實中含量較高，

9、某些植物的葉子如煙葉，以及動物的肌肉、唾液中也含有檸檬酸。檸檬酸是現在以生物化學方法生產產量最大的有機酸，也是世界上應用最廣泛的有機酸。因其無毒、具有溫和爽快的酸味，水溶性好、酸味適度、易被吸收和價格低廉等優點，被廣泛應用于食品工業中，占食品酸味劑用量的 60以上。主要被用作酸味劑（與檸檬酸鈉并用使酸味更加柔和，主要用于果汁、果凍、果醬、水果糖、冰棒、雪糕、食品、糕點等）、增溶劑、緩沖劑、抗氧化劑、除腥脫臭劑、風味增進劑、膠凝劑、調色劑，番茄、豆類、胡蘿卜等蔬菜罐頭的 pH 調節劑等。檸檬酸作為重要的食品酸味劑除了能改善食品風味外，還兼有抑制微生物生長、護色、改善黏度和流變性等作用。而且在醫藥

10、、飼料、化工、電子、紡織、石油、皮革、建筑、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業領域也都有十分廣闊的應用。 為了給黑曲霉檸檬酸發酵創造好的條件，本實驗研究了玉米粉凊液發酵的工藝條件。并為黑曲霉檸檬酸補料發酵打下了基礎。本實驗利用搖瓶發酵在實驗室采用單因子實驗和正交實驗研究了黑曲霉 Wsy-03 的最佳發酵培養基組成（包括碳源，氮源），并對影響黑曲霉檸檬酸發酵的發酵溫度、發酵初始 pH 及過程中 pH的控制、發酵接種量進行了研究，利用小型自控發酵罐對發酵溶解氧對黑曲霉檸檬酸發酵的影響形成進行了系統研究，以尋求最優發酵培養基和發酵控制條件，同時檸檬酸的補料發酵的研究提供可靠依據和堅實基礎。2.實驗儀器藥品

11、材料及分析方法2.1實驗設備 電子天平、生化培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫水浴鍋、堿式滴定管、離心機、搖床、電磁爐、酸度計。2.2實驗試劑及材料 NaOH溶液、葡萄糖、瓊脂、酚酞、玉米粉、Na2SO4、污水乙醇、蒸餾水、鹽酸、碘液、-淀粉酶、甲醇、（NH4）2SO4、MgSO4、KH2PO4。2.3 菌株 以檸檬酸主要生產菌株黑曲霉(Aspergillus niger)作為實驗菌株。2.4分析方法 通過改變發酵條件，最后測定產酸率確定各因素溫度、PH、溶氧、裝料系數、接種量等單因素的最佳發酵條件。本次實驗通過改變溫度、PH、溶氧、裝料系數、接種量等條件在搖床中發酵培養黑曲霉，并最終測定檸檬酸產率

12、確定最優發酵條件。五種單因素實驗都分別取五個相鄰的條件作為對比，每個條件都做三個平行實驗求平均值。3.實驗設計3.1培養基制備（1）馬鈴薯葡萄糖培養基：將新鮮土豆洗凈去皮，稱取100g切塊，加入500ml蒸餾水，在白瓷缸中煮沸約20min，用8層紗布過濾，取濾液，加蒸餾水補溶液至500ml。將濾液繼續加熱，并加入10g葡萄糖，10g瓊脂。待瓊脂融化，即可。 （2）玉米淀粉培養基：將市售玉米粉經50目標準分樣篩處理后，取30g玉米粉加入到250ml錐形瓶中，加入蒸餾水100ml，甲醇4.5ml，（NH4）2SO4 0.3g、MgSO4 0.075g、KH2PO4 0.3g，-淀粉酶0.5g。于7

13、0液化15min后用0.1%碘液檢測不顯藍色或極微淡藍色，即糖化完全。四層紗布過濾于250ml三角瓶即得糖化清液。3.2斜面種子和液體種子的制備 將冰箱保存的黑曲霉斜面菌種轉接到斜面活化PDA培養基上，37恒溫箱中培養2-3天，此時培養基上長滿大量黑色孢子的黑曲霉菌落，即為試管斜面活化。將已滅菌好的液體種子培養基拿到無菌室進行接種，用酒精燈燒過的接種環輕輕刮下3-5環孢子，接種到已冷卻好的液體種子培養基內，包扎好后搖床28、200r/min培養24h，進行種子搖床培養。3.3溫度對檸檬酸發酵的影響 在無菌的條件下，用10ml的無菌移液管吸取10ml的液體種子，轉入已滅菌的發酵培養基中，在30,

14、32,34,36，38條件下，設定轉速為200r/min，發酵時間為72h，進行搖床發酵培養。發酵完成后，測定不同的溫度條件下發酵液中檸檬酸的含量，確定檸檬酸發酵的最適溫度。3.4溶解氧對檸檬酸發酵的影響 在無菌條件下，用10ml的無菌移液管吸取10ml的液體種子，轉入已滅菌的發酵培養基中，在34調節不同的轉速，分別為150r/min,200r/min,250r/min,300r/min，350r/min，設定發酵時間為72h，發酵完成后測定不同轉速下發酵液中檸檬酸的含量，從而確定檸檬酸發酵的最佳轉速。3.5接種量對檸檬酸發酵的影響 在無菌的條件下，保持其他條件不變，分別以6%，8%，10%，

15、12%，14%接種量吸取液體種子到發酵培養基中，在34下，設定轉速為300r/min，發酵時間為72h。發酵完成后測定不同的接種量條件下發酵液中檸檬酸的含量，確定檸檬酸發酵的最適接種量。3.6發酵液有效體積對檸檬酸發酵的影響 將搖瓶發酵培養基調配至最適培養基組成及最適pH值后滅菌。在無菌操作下，用無菌移液管吸取5ml,7.5ml,10ml,12.5ml.15ml的液體種子，分別轉接入已調配好的發酵培養基即50ml，75ml，100ml，125ml，150ml中。在34下，設定轉速為300r/min，發酵時間為72小時進行發酵培養。發酵完成后，測定在不同的發酵液有效體積條件下發酵液中檸檬酸的含量

16、，確定在最適培養基組成下的最適發酵液有效體積。3.7初始PH值對檸檬酸發酵影響 調整搖瓶發酵培養基的初始pH值為6.2,6.5,6.8,7.1,7.4后進行高壓蒸汽滅菌。在無菌操作下，用無菌移液管吸取10ml的液體種子，在34，設定轉速為300r/min，發酵時間為72h，發酵完成后測定不同的初始pH值條件下發酵液中檸檬酸的含量，確定檸檬酸發酵的最適初始pH值。3.8檸檬酸的測定取5ml發酵液，離心取上清液，精確吸取4ml，加入100ml錐形瓶中，加入2-3滴0.1%酚酞指示劑，用0.1429 molL進行滴定，滴定至微紅色，平行滴定3次，記錄平均消耗NaOH的體積。滴定1ml樣品液

17、，每消耗1ml0.1429mol/LNaOH時的溶液為1%酸度，也即為發酵液產酸率（%）4.結果與分析4.1不同初始PH的檸檬酸產率 實驗室內的搖床三角瓶發酵，調節合適的發酵初始 pH 值十分重要。特別是像檸檬酸發酵這種以淀粉作為發酵原料的發酵，發酵液初始 pH 的高低會直接影響到菌體糖化酶的活力，由于檸檬酸發酵是以玉米粉為原料的發酵過程，屬于邊糖化邊生長邊產酸的過程。初始 pH 值過低，會直接導致糖化酶活性低，淀粉不能完全水解，同時較低發酵 pH 值，會生成亞鐵氰化物，該化合物對黑曲霉菌體的生長有毒害作用。反之如果發酵液初始 pH 值較高，會使發酵過程中草酸和葡萄糖酸大量積累，使發酵液中雜酸

18、含量過高。不同發酵液初始 pH 值對檸檬酸發酵產量的影響，見表1、圖1。表1.不同初始PH值的檸檬酸產率初始PH發酵液產酸率（%）6.20.126.50.176.80.237.10.217.40.18圖1. 由表1.圖1.可以看出，黑曲霉在進行檸檬酸發酵時，只有發酵液初始PH為6.8 時，產酸率最高。如果發酵液初始PH調節過高或者過低時，都會對最后的產酸率有影響。究其原因主要是，PH6.8與糖化酶的活性最高PH值基本一致，如果起始PH低于糖化酶的作用最適范圍，會使得發酵原料得不到充分利用，進而影響最終產酸率。反之如果發酵液初始PH過高，則黑曲霉菌絲球會出現老化現象，提前進入衰老期，如果初始發酵

19、PH值更高還會引起菌體自溶。所以，發酵液初始最適PH值為6.8。4.2不同接種量的檸檬酸產率 檸檬酸發酵接種量多少，直接影響著檸檬酸發酵產酸量的多少。發酵初始接種菌絲球數量如果太少，則在發酵過程中，發酵動力不夠，影響糖酸轉化率。如果接入的菌絲球量太多，則菌絲球成球效果不理想，會使發酵液濃度增大，影響溶氧使產率下降。所以研究發酵接種量對檸檬酸發酵產酸的影響較大，不同接種量對檸檬酸發酵產酸的影響見表2、圖2。表2.不同接種量的檸檬酸產率接種量（ml）發酵液產酸率（%）60.1480.19100.25120.22140.18圖2.由表2.圖2可見，黑曲霉發酵檸檬酸時，接種量在10%以下，這時產酸量會

20、隨接種量的提高而增加，但是如果發酵接種量超過10%以上還繼續增加接種量，產酸反而會隨著發酵接種量的增加而降低。所以在試驗中控制發酵接種量在10%左右即可以達到較好的發酵結果。4.3不同溫度的產檸檬酸率由于酶活受溫度的影響也十分明顯，所以合適的發酵溫度對產物的積累十分重要。在檸檬酸發酵過程中，如果發酵溫度過低則糖化酶的活性低，難以完成對原料的轉化，使菌體生長緩慢。但是如果發酵溫度過高，容易引起菌體老化過快發酵后勁不足、雜酸如草酸的積累過多等現象。不同發酵溫度下發酵產酸的結果見表3、圖3.表3.不同溫度的產檸檬酸率溫度（）發酵液產酸率（%）300.13320.15340.20360.12380.1

21、0圖3.由表3.圖3.可以看出，發酵溫度對黑曲霉產檸檬酸發酵影響較大。溫度低于 34時，產酸率會隨溫度的升高有所提高。而當發酵溫度高于34以后，高溫導致呼吸作用加強從而致使菌體形成過量，造成菌體過早進入衰老期，影響糖酸轉化率。所以綜合考慮菌體生長、產酸率等各個方面，黑曲霉的發酵溫度應控制在34為宜。4.4不同發酵液有效體積的產檸檬酸率 不同的發酵液有效體積對黑曲霉菌體的生長和發育有很大的影響，從黑曲霉發酵產檸檬酸的過程分析如果發酵液有效體積過小會因營養成分不夠影響菌體生長和發育，如果發酵液的有效體積過大會影響溶解氧也會影響黑曲霉的產酸率。表4.不同有效體積的產檸檬酸率發酵液有效體積（ml）發酵

22、液產酸率（%）500.28750.251000.201250.171500.10圖4. 由表4.圖4.看出，發酵液有效體積對黑曲霉發酵產檸檬酸呈反比，有效體積越大，產檸檬酸率越低。當發酵液有效體積在50ml的時候，黑曲霉產檸檬酸最多。其根本原因可能是裝料的體積越多，發酵瓶內的體積較小，不利于菌種的發酵，導致產酸率較低。但考慮到節省成本，所以最終確定發酵液的有效體積最優的是100ml。4.5不同溶氧的產檸檬酸率黑曲霉是好氧菌,它的溶氧水平是其合成代謝的關鍵。在搖瓶發酵階段,影響溶氧水平的主要因素就是搖瓶的轉速。不同的發酵液的溶氧量對檸檬酸發酵產量的影響，見表5、圖5.表5.同溶氧的產檸檬酸率轉速

23、（r/min）發酵液產酸率（%）1500.102000.142500.193000.233500.25圖5.由表5.圖5.結果可知,搖床轉速在350r/min的時候黑曲霉產檸檬酸最多。由于常規搖床轉速受到一定的限制,如果再提高轉速,瓶內震動的過于劇烈,可能產生意外,不宜再提高速,所以在設備條件有限的情況下300r/min是一個比較理想的攪拌速度,發酵菌可以最大程度獲得溶氧。黑曲霉是好氧菌,它的溶氧水平是其合成代謝的關鍵。在搖瓶發酵階段,影響溶氧水平的主要因素就是搖瓶的轉速。4.6正交實驗及結果在上述單因素實驗的基礎上，可知溫度和溶氧對黑曲霉發酵產檸檬酸過程有很大的影響，所以我們決定以溫度和溶氧

24、進行了正交試驗。我們需特別要求在發酵過程中控制好發酵溫度，其次是控制好溶氧。優化的工藝條件為34和300r/min，最終檸檬酸的產量為0.23%，說明該條件為最佳的發酵工藝條件。5.結論與展望5.1結論 本文以玉米粉為原料對黑曲霉檸檬酸發酵過程進行了研究,不僅對發酵過程有了更深入的認識,而且取得了良好的優化結果。 實驗分別從考察溫度、PH、接種量、溶氧、發酵液有效體積與產酸之間的相關特性對黑曲霉發酵過程有了初步的了解,通過對各個參數的相關性進行分析,確定了對黑曲霉發酵過程的控制策略,即在250ml錐形瓶中，發酵培養溫度控制在34；PH控制在6.8、攪拌速度控制在350r/min、接種量控制在10%、發酵液有效體積控制在50ml，黑曲霉產檸檬酸產率最高。5.2展望 提高代謝產物積累的方法不勝枚取,但無外乎兩方面,首先是菌種改良,特別是隨著基因工程技術的發展,比如轉基因技術,它在提升菌種品種方面可以菌種有質的飛躍,但是我國檸檬酸生產企業比較分散,規模有大有小,科研實力參差不齊,和西方一些國際檸檬酸生產巨頭相比還有較大差距,但這并不代表傳統的分離純化已經失去了地位,相反,分離純化目前仍然是大部分企業的基礎性工作,無可替代,因為菌種經過幾代培養后,各項性能都會衰退,所以必須對已經退化的菌株進行淘汰,保持優良菌種,而且本實驗已經證明菌種分離純化仍然可以顯著提高檸檬酸產量,這是最經濟,最