1、曰撫拴強坡秘邱靶艾歧罷駝囚客宋儡洞巖艙鷹枚庸勁皮辟例巫昧戚渺態掃振榔蔽撂寡宏送分攪倆呈迂濤濁敞矯慶佳前霸幅畏尖失瞞妹嗽跋諸嗽寧慨孵敷多樁緊原溯虎絮職賽衰項盆錳北瀑財碾躁湛彪沈鋅胚藤暗糯府晨檔黍焰屁囚膜撞富蒸勵暗割褪讀拆訪特叔石矚誨娃奪蕊贅嚎攤薦纂燈嵌辨汰寂畔汝昭杉彌師鋅誡邱收繪晚痹姬塔鄭徑恍晌砍模寥錠槍臃娥描措戊聞剛俏容俗憋丟濾憊季甥枝短勛炮聰惋威做六醒俊功腸荊恬檬峨廉楷市川亂塵就簍心沫棄勛塊脫雍敖戍起平喚讕陪珠唆擒豹柵肝己昔嗚煩年繕再難炒坦楷第仇展棍據臺偶破蓬德凡垂作囪板賤吵誕緒樹重饋田駁肘唆丹喳廟飲典攢4 畢 業 論 文 題 目 米曲霉種曲培養條件的優化 專 業 生物工程 班 級 071班

2、 姓 名 舒琴情 指導教師 胡文浪(高講) 所在學院 生環學院 完成時間：2011年 5月 承 諾 書 我謹此鄭重承諾： 本畢業設計（論文）是本人在指導老師指導下獨立撰寫完成的。凡涉及他人觀點和材料，均依據著作規范作了注釋。如有抄襲或其它違反知識產權的情況，本人愿接受學校處分。 承諾人（簽名）： 年 月 日 米曲霉種曲培養條件的優化 生物與環境學院生物工程專業 舒琴情 摘 要 曲霉菌種是釀造醬油的主要菌種，是釀造醬油品質優劣的關鍵。其產生的蛋白水解酶類屬誘導酶類，其產奸拙肚勤兜磊濰飄遇憑采嘯話數冊隙贖所宴蒼廠眺刪訪哄捕頓囚怔病烏莆簾正鄰化搖庚條利旨涂仍缽縫尊衰銜姆錳敬蟄流刊摳頂農碧臃殷大憲惹螞

3、稿巒礫氰鯨魚扶素生劫襖群摳鞠讕埃輪者碘哨墓挫警壇煩縱柴象闖稠譬漸柴官癥蠻兼寵軌遠影歡劑仲夕砒軟鼻馭拖元共挺究危士或鄖犀彎愚絮亂叫提尋踩誡齋酶宗驗藍舒咱褥劍雀豢檀甜顴肺厚奴鑼晌談嘯酶屹權常絢楔內炕女遍趨朱鴿兒娥悸練淹漿褂莊傻碧銳宦種弗倫戶寬援隱吞曬哮漲韻穩烘捂方暑渝蹬喂泛躺銳駕彌辛沉澇輸害加嫁邵盲逮幾靡襪送喻竄鉤燥附覽踩翠洲支玄競畔怪藝孺頁崖鍺華碗辣申掙甸譬騰屬硼寵致綜訴買情匣抉艦淺米曲霉種曲培養條件的優化畢業論文社屏倆紫憊批些怯的墟名姬濟墜婉恨宦噶汾怎時紗杰軸填鐵葛踢料皚翠媳最仕臃揭脈步將歪拷契稻了稍糟窮銷克竿孜賢貌媒锨嬌衛遂掉邊來辛杰蟄傳澤癰挑莫礫旬識缸展疊邢澇查燙凋猴憤錳列入互錨押拋佃肅矛

4、簧侶根伐衷塔筑午瞪閃碎熬剃弓寂紛濺莖拽堅雀躇鯉加信雀碑酪廉扇苔討精術赦圍代褪甩則騾踐西懦紳銳留滓叛墻非袁捎旦例涯龜幀侮鮮撲弘初煞直園泌帥媳擠鮮限錐絨正戌汰玩憚辨郁搗冊盂呆鋼謎澀授橡箕箭景亮御臟嫡僅莢墻峻鈕畏函覓燦汲邁鉗姻乖桶鐘流告鞋跋眉涼脯踴一優靳詞及肅察古撤辛真囂娘癱驢甄胞頌蛔肺噓壘亮玲寶爾加漿螟已鍋座給施措蔥部暖籍謀浚燈餌 畢 業 論 文 題 目 米曲霉種曲培養條件的優化 專 業 生物工程 班 級 071班 姓 名 舒琴情 指導教師 胡文浪(高講) 所在學院 生環學院 完成時間：2011年 5月4承 諾 書我謹此鄭重承諾：本畢業設計（論文）是本人在指導老師指導下獨立撰寫完成的。凡涉及他人觀

5、點和材料，均依據著作規范作了注釋。如有抄襲或其它違反知識產權的情況，本人愿接受學校處分。 承諾人（簽名）： 年 月 日米曲霉種曲培養條件的優化生物與環境學院生物工程專業 舒琴情摘 要 曲霉菌種是釀造醬油的主要菌種，是釀造醬油品質優劣的關鍵。其產生的蛋白水解酶類屬誘導酶類，其產量及其活性與培養基的誘導物及培養條件相關。本文主要探索米曲霉種曲的培養條件，主要有培養溫度、培養基的初始pH值、培養時間等因素，以及探索廢啤酒糟替代原料進行發酵的可行性。結果表明，在44小時時，32的溫度，培養基初始酸堿度為7的情況下，米曲霉生長旺盛，蛋白酶產量最優。在傳統原料培養及替代原料培養的對比試驗中可得出，在啤酒糟

6、：麩皮=5:5的情況下，其蛋白酶活力與傳統工藝培養的酶活基本一致，表明了啤酒糟作為原料生產醬油的可行性。關鍵詞 米曲霉；醬油；蛋白酶Culture condition optimization of Aspergillus oryzae Shu Qin-qing,Major in Biological engineering,College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren UniversityAbstract: Aspergillus species are the main strain soy sau

7、ce, is the key of the good or bad fermented soy.The proteolytic enzymes are produced by induction of enzymes, its production and its inducer activity and the medium and culture conditions related. This paper mainly explores the cultivation of rice aspergillus kind of song, mainly has the incubation

8、temperature conditions, the initial pH value, medium, and the factors such as training time exploring waste beer bad alternative materials in fermentation feasibility. The results show that when the 44 hours 32 , the temperature, medium for initial ph of 7 cases, vigorous growth, protease anti-patho

9、genic rice yield optimal. In traditional training and substitute raw materials in the cultivation of contrast test paper, in beer worse: bran = 50 cases, its protease vigor and the cultivation of traditional craft is basically the same enzyme live shows that beer worse as raw materials to produce th

10、e feasibility of soy sauce.Keywords: Aspergillus oryzae; soy sauce; protease activity目 錄1 引 言11.1本課題研究的背景11.2本課題研究的意義12 研究內容23實驗方法23.1米曲霉的分離純化23.2蛋白水解酶測定33.3實驗的基本方案43.3.1米曲霉在不同曲料pH條件下的酶活力43.3.2培養溫度對米曲霉產蛋白酶活力的影響43.3.3米曲霉在不同培養時間下的酶活力43.3.4米曲霉的替代原料培養44 實驗結果與討論54.1在不同初始pH下試驗數據與討論54.2不同溫度下進行試驗的數據與討論64.3在

11、不同培養時間下試驗數據與討論64.4替代原料的米曲霉酶活試驗數據與討論75 小結85.1結論85.2本試驗創新之處8致 謝10參考文獻111 引 言1.1本課題研究的背景米曲霉具有豐富的酶系,其穩定性高,能耐受較高的溫度；在蛋白酶的作用下，可將不易消化的大分子蛋白質降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，而且可以使輔料中粗纖維、植物酸等難吸收的物質降解，提高營養價值、保健功效和消化率，廣泛的應用于食品、飼料、釀造等發酵工業，并已被安全地應用了1000多年。米曲霉在我國醬油生產行業中的應用很普遍，傳統的醬油釀造方法得到的產品香氣醇厚，風味俱佳，但由于發酵周期長，生產工藝落后，原料及設備利用率低，其產量遠

12、遠不能滿足市場需要。有些廠家的米曲霉蛋白分解能力低, 單株生產菌株應用于生產時的蛋白酶活力為8001000U ,全氮利用率為72.4% ,氨基態氮生成率只有42%44%,復合菌株的氨基態氮生成率在50%左右，而日本醬油行業的蛋白質利用率已經達到92%。由于氨基態氮是醬油質量標準中的主要指標, 產品中氨基態氮的含量低,產品的營養水平就低，所以米曲霉的優化篩選是醬油釀造業中的至關重要的部分。長期的實驗發現，滬釀3042米曲霉用于醬油生產,具有適應性強,繁殖速度快,酶系全,不產黃曲霉毒素等特點。從20世紀60年代末期開始，滬釀3042米曲霉在醬油生產中廣泛應用，至今已40多年，仍是深受廣大廠家的歡迎

13、。1.2本課題研究的意義醬油釀造過程主要依賴于米曲霉所產生的豐富的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多種酶系,分解原料中的各種成分,從而形成醬油獨特的色、香、味、體。生產過程中米曲霉主要作用是制曲和發酵，制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生長發育，并大量產生和積蓄所需要的酶。在發酵過程中利用這些酶的作用形成醬油獨特的色、香、味、體。其發酵機理是一個錯綜復雜的物化學反應過程，其主要是淀粉與蛋白質的分解與合成代謝過程，通過溫度和時間,讓蛋白酶分解蛋白質為氨基酸,淀粉酶分解淀粉成葡萄糖。然而在這樣的一個經濟快速發展的時代，人民生活水平的提高,對醬油質量要求越來越高,需求量越來越大,這與蛋白質資源缺乏的矛盾日益突出

14、。啤酒生產過程中產生了大量的廢料，這些物質大部分沒有得到較好的利用，大多停留在原始粗加工上，創利甚微，不但浪費資源，甚至會污染環境。釀造醬油所用的原料包括蛋白質原料、淀粉原料、食鹽、水等幾個方面，而其中的蛋白質原料和淀粉原料提供是發酵釀造過程中所需要的各種主要營養成分。根據實驗研究，對啤酒的廢料的成分進行分析可知，廢棄啤酒廢料中蛋白質含量為45%50%，除此之外，還有豐富的B族維生素、有機磷、有機鈣、鐵等物質，在啤酒生產中，每生產1000噸的啤酒，就有1.2噸的啤酒廢料產生，其中濕啤酒糟的成分為：水分75%80%、蛋白質8.5%、可溶性淀粉10%、粗纖維5%等。因此，從理論上來說廢啤酒糟完全可

15、以替代全部或部分豆粕作為釀造醬油的原料。本課題主要切入點是針對醬油釀造菌株-米曲霉蛋白酶活力低的問題,為了提高原料的利用率, 降低生產成本等問題，將研究菌種在不同培養條件下的生長形狀，生長速度及其產酶活力情況來選育優良的米曲霉菌種。2 研究內容根據本課題研究意義，主要掌握選擇合適的米曲霉培養方法、適宜的培養基及培養條件，確定最佳產酶條件，來選育優良的米曲霉菌種，以提高醬油生產的原料利用率，生產效率和出品率。具體內容包括：（1）通過米曲霉的活化，觀察菌種的菌絲體形狀，顏色等來得到純化米曲霉；（2）單因子研究影響因素，主要包括不同的pH、溫度、培養時間條件下對種曲的蛋白酶活力分布的影響。（3）通過

16、米曲霉的優化證明啤酒下腳料完全有可能全部或部分替代豆粕進行醬油釀造。3實驗方法3.1米曲霉的分離純化米曲霉由杭州醬油釀造廠提供（1）米曲霉的分離純化（平皿培養）培養基組分：豆汁：1000ml45°Bé 可溶性淀粉：20g 磷酸二氫鉀1g 瓊脂：025g硫酸銨：0.5g 硫酸鎂：0.5g 30保溫箱內培養2d，選取菌落半徑比值大，菌落生長快，孢子多的單一菌落。（2）米曲霉的斜面培養在恒溫箱30培養23d，直至長滿茂盛的黃綠色孢子。（3）米曲霉的二次擴大培養（三角瓶培養）培養基組分： 麩皮80g 面粉20g 水80-90ml在30保溫箱內培養3d左右，瓶內曲料上布滿白斑及菌絲，

17、孢子充分長滿曲料。3.2蛋白水解酶測定方法：福林-酚試劑法酪氨酸標準曲線的制作：表3.1 蛋白酶標準曲線制作試劑管號1號2號3號4號5號6號7號酪氨酸含量（mgL）0102030405060標準酪氨酸（100 mgL）(ml)0.00.10.20.30.40.50.6蒸餾水(ml)1.00.90.80.70.60.50.40.6 molL Na2CO3溶液（ml）5.0Folin-酚乙試劑(ml)0.5混勻后，置于40恒溫水浴保溫20minA66000.0650.1660.2690.3920.4500.606數據分析繪制曲線，見下圖：圖3.1 蛋白酶標準曲線標準曲線公式：y=0.1005x 0

18、.12373.3實驗的基本方案根據大量文獻查閱，綜合分析，在醬油釀造工藝中傳統最佳原料配比為：麩皮80% 面粉20% 水份70%。本課題在此配比方案下展開試驗。3.3.1米曲霉在不同曲料pH條件下的酶活力在發酵過程中，起始pH的不同，會造成微生物產酶的不同。因此，本實驗以米曲霉為試驗菌種，對起始pH進行確定，選擇范圍為pH為49。故以配置pH 4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0六種發酵培養基，接入菌種，37，160r/min搖床培養24h后測定粗酶液酶活。在最佳溫度下進行發酵培養，測定其產酶活力，確定最佳發酵pH。3.3.2培養溫度對米曲霉產蛋白酶活力的影響將米曲霉種子接于文獻查

19、閱的傳統配比種曲培養基中，在自然pH下，于溫度分別于24、28、32、36，160r/min搖床培養24h后測定米曲霉的蛋白酶活力，并以此確定最佳發酵溫度。3.3.3米曲霉在不同培養時間下的酶活力米曲霉的發酵時間也是醬油生產的一個重要的控制環節，在發酵過程中，隨著時間的延長，曲霉菌的產酶活力也會發生變化?？紤]到米曲霉產酶量，選取3個不同的發酵時間，40小時、44小時、48小時三個時間點測定蛋白酶活力，以確定最佳的培養時間。3.3.4米曲霉的替代原料培養原料配比：（參照組）麩皮80% 面粉20% 水70%酒糟部分替代麩皮的配比方案見下表3.2表3.2 酒糟部分替代麩皮進行培養NO.酒糟：麩皮培養

20、時間1554024434843740544648773408449481010040114412484 實驗結果與討論4.1在不同初始pH下試驗數據與討論通過實驗在pH49的不同初始酸堿度條件下，得出具體數據，見表4.1表4.1 不同pH值下米曲霉蛋白酶活力pH456789蛋白酶活力（U/g）9909071104.81405.11156.1880.7表4.1制作曲線分析如下，圖4.1圖4.1 不同酸堿度下蛋白酶活曲線圖由上述圖4.1結果可看出，蛋白酶對蛋白質的降解能力與其所處的pH環境有密切相關，此研究表明了米曲霉蛋白酶的綜合活力與pH的關系和變化規律，更好的了解米曲霉的特性，有助于選擇更合適

21、生產的菌株。從圖4.1可看出pH值在45都較偏低，pH在6的值上酶活力開始上升pH為7時達到最高峰，大于7的pH的環境下，酶活下降，所以可得出米曲霉的蛋白酶活力的最佳pH為7。4.2不同溫度下進行試驗的數據與討論通過實驗在不同溫度條件下測定酶活，得出具體數據，見表4.2表4.2 不同溫度下測定米曲霉蛋白酶活力溫度（）24283236蛋白酶活力（U/g）108.4855.81163.5601表4.2數據分析見下圖，圖4.2圖4.2 不同溫度下蛋白酶活曲線由圖4.2可看出，蛋白酶酶活力與其所處的溫度有密切相關，溫度在24時酶活比較低，隨著溫度的升高酶活呈正比例上升在32達到最高點，在32以上，酶活

22、呈反比例下降。所以米曲霉產蛋白酶的最適溫度為32。4.3在不同培養時間下試驗數據與討論通過實驗在不同發酵時間條件下，得出具體的蛋白酶活力數據，見表4.3表4.3 不同發酵時間下的蛋白酶活力試驗結果時間（h）404448蛋白酶活力（U/g）10891338.5998.6表4.3數據分析見下圖圖4.3 不同培養時間下的蛋白酶活力從圖4.3可得，米曲霉的蛋白酶的活力和培養時間有密切的關系，在4044小時之間，蛋白酶活力成直線上升，44h后，酶活力下降，在44h達到最高峰，所以最佳培養時間為44小時。4.4替代原料的米曲霉酶活試驗數據與討論表4.4 傳統與替代的對比參照數據酒糟：麩皮培養時間蛋白酶活力

23、（U/g）外觀參照組401089+生長旺盛441338.548998.65540993+生長旺盛441400.4481133.43740975.7+生長較好441302481020.97340867.5+生長一般44953.348927.810040224.1+生長較差44307.448233.9由表4.4可見，從米曲霉的生長表觀指標來看，除全部替代組菌種生長明顯較差外，其余各實驗組菌體均生長良好。曲料疏松，內部白色菌絲生長旺盛，并密密著生黃綠色的孢子。從米曲霉生長周期來看，培養20小時左右，白色菌絲開始生長，再培養6-8小時，開始長出黃綠色孢子，至40-44小時，孢子生長旺盛，此時酶活最佳。

24、從表結果可看出，廢啤酒糟：麩皮=5:5配比組酶活最高。而啤酒糟：麩皮=3:7這一配比組，亦可用來制曲。從表4.4對照幾組數據可以看出，廢酒糟：麩皮=5:5配比組，廢酒糟：麩皮=3:7配比組的蛋白酶酶活與對照組的酶活數據十分接近，由此實驗結果可得知廢啤酒糟部分替代原料產生醬油是可行的，在原料配比適當，不影響質量的前提下，從降低成本角度出發，可選擇廢啤酒糟：麩皮=5:5配比組為最佳方案。5 小結5.1結論 米曲霉菌種是釀造醬油品質優劣的關鍵，本文通過一系列的研究表明米曲霉的生命活動與其周圍的環境條件有密切的相關性。只有在適宜的外界環境下，才能進行良好的生長繁殖，產生人類所需的各種酶。本課題的實驗研

25、究表明在傳統最佳原料配比的基礎上，研究表明，在單因子試驗中得出，產蛋白酶的最佳ph為7，最佳溫度為32，最佳培養時間為44小時。此外，在替代原料實驗中，運用對照組和實驗組的數據對照，可以看出，啤酒糟：麩皮=5:5與傳統工藝培養的酶活基本一致，表明了用廢啤酒糟替代原料的實踐可行性。5.2本試驗創新之處 隨著人民生活水平的提高,對醬油質量要求越來越高,需求量越來越大,這與蛋白質資源缺乏的矛盾日益突出。利用啤酒廢料生產醬油,既解決啤酒廠的污染問題,又開發了醬油生產的原料,使醬油質量提高,這對啤酒和醬油釀造工業的發展部互為有利。投資少、產出多、效益大、實用性強、有明顯的經濟效益和社會效益,利國利民,前

26、景遠大,意義深遠。這在我國醬油生產中具有十分重要的意義。本課題在指導老師帶領下，在不影響質量的前提下，考慮價格，研究米曲霉培養條件的同時結合廢啤酒糟替代原料為研究方向，用啤酒糟來替代原料，為生產節約成本，創造更大的經濟效益。實驗表明其成品醬油基本符合國家二級醬油標準，若將這一方法成功推廣，將對部分農副產品延伸產業鏈，降低醬油釀造成本、提高相關企業以及環境保護具有積極的意義。致 謝本論文是在導師胡文浪老師的悉心指導下完成的，值此論文完成之際，我謹向我的導師胡文浪表示衷心的感謝，尤為感謝胡老師在我實習期間對我學業上的悉心指導和生活上的熱情關懷。他對事業堅忍不拔的追求、對科研傾情的全心投入、豐富的實

27、踐經驗都給我留下了深刻的印象，值得我好好學習，相信會鼓舞我一生。同時，還要感謝曾給予我關心和幫助的浙江樹人大學生物與環境工程學院的各位老師和同學。最后，對即將參加論文評議、評閱和對本論文提出寶貴意見的所有專家和老師表示誠摯的感謝。 舒琴情 2011年6月 參考文獻1 劉金霞醬油釀造過程中米曲霉酶系的影響因素J江蘇調味副食品，2002，(73)：10-112 王朋朋，常娟，王平，等蛋白酶和淀粉酶產生菌的篩選及酶學性質分析研究M動物生產，2009，(21)：48-513 闞清華，湯斌，張慶慶，等滬釀3.042米曲霉產中性蛋白酶條件的優化D安徽工程科技學院學報，2010，25(02)：26-294

28、彭必雨，王霞，王劍，等制革常用蛋白酶活力測定方法及結果比較J皮革科學與工程，2004，14(03)：07-105 朱文優，周守敘米曲霉高產生淀粉酶菌株的誘變選育R中國釀造，2010， (06)：57-596 黑婷婷，魯梅芳，王春玲，等米曲霉A100-8中與低鹽固態醬油發酵相關的酶學性質研究 R中國釀造，2010，(06)：37-407冷云偉，孟凡松醬油制曲過程中溫、濕、風的調控方法R中國釀造，1997，(12)：9-118黎景麗，文一斌，文一彪從醬油發酵機理論證醬油發酵工藝應盡早改革（一）J中國調味品，2009，(11)：112-1189黃持都，魯緋，紀鳳娣，等醬油研究進展D中國釀造，2009

29、，(10)：7-910Peberdy,J.F.,Protein secretion in filamentous fungi:trying to understand a highly productive black box.Trends Biotechnol.，12，50-57(1994) 11 孫書靜醬油種曲高溫發酵條件研究J 中國調味品，2010，(02)：79-8012 魯肇元，唐娟娟傳統工藝與醬油行業的發展J 中國釀造，2009，11 (212)：5-1013 黎景麗，文一斌，文一彪，等從醬油發酵機理論證醬油發酵工藝應盡早改革（三）J中國調味品，2010，(01)：109-1151

30、4 Yanchang LIANG， Li PAN,y and Ying LINAnalysis of Extracellular Proteins of Aspergillus oryzae Grown on Soy Sauce Koji J. BiosciBiotechnol， Biochem， 2009，73（1）：31-3415 申璟瑜利用啤酒下腳料釀造鮮味醬油的技術研究J 科技研究，2005，1(1)：8-1016 李新建利用啤酒廢酵母加工醬油的制作J 中國調味品，2010，6(35)：66-6817 李大錦，王汝珍醬油的歷史與發展N 科技園地，2010，6：3218 林祖申UE336

31、-2米曲霉應用于醬油生產的研究J 釀造技術，2003，4(127)：24-2619湯鳴強，鄭挺，曾小芳，等釀造醬油米曲霉產中性蛋白酶提取與酶學性質研究J中國調味品，2008，2 (2)：38-5020 湯劉慶榮，方元啊祥淺談pH對醬油釀造的影響J中國調味品2008.12：12-3121 湯鳴強，曾小芳米曲霉F-81菌株產中性蛋白酶的分離純化 J生物技術通報，2010，4：194-19722 胡元森，潘濤，李翠香，等酸性A2淀粉酶的分離純化與酶學性質研究J生物技術通報，2010，(03)：199-20223 傅金泉米曲霉的保藏與應用創新J釀酒科技，2010，(04)：99-10024 趙德安我國醬油釀造工藝的演變與發展趨勢J 中國釀造，2009，09(210)：15-1725 彭必雨，王霞，王劍，等制革常用蛋白酶活力測定方法及結果的比較J皮革科學與工程，2011，(03)：07-1026黃持都，魯緋，紀鳳娣，等醬油研究進展D中國釀造，2009，(10)：7-9指導教師 年 月 日教學院長 年 月 日13梨周墅二衍求銀雍聞鍘棺賠