1、藁本中主要有效成分阿魏酸在大鼠體外及體內代謝研究項目完成單位：國家藥物及代謝產物分析研究中心項目完成人：張金蘭摘 要 對藁本中主要活性成分阿魏酸在大鼠體外及體內的代謝進行了研究，研究結果表明阿魏酸在大鼠體外肝微粒體溫孵體系中不代謝，也就是說阿魏酸不易發生氧化及還原型反應；建立了大鼠生物樣品（尿、糞、膽汁及各種組織器官）前處理方法及HPLC-DAD分析方法，分析了給藥后大鼠的尿、糞和膽汁，結果表明阿魏酸在大鼠體內的代謝轉化率很低，主要以原藥形式從尿中排出體外，糞中很少，膽汁中幾乎沒有；對尿樣中代謝物進行了HPLC-MS分析，并對主要代謝物進行了制備及MS/MS分析，確定了大鼠尿中3個代謝物的結構

2、，均為阿魏酸的葡萄糖醛酸型結合物。對阿魏酸在大鼠組織臟器中的分布研究表明，大鼠口服阿魏酸2小時后，主要分布于肝、腎、脾、肺；心臟中沒有發現，另外胃中仍有大量阿魏酸存在。綜合以上結果對阿魏酸在大鼠體內的代謝及排泄途徑進行了推斷。一、研究背景 藁本為傘形科藁本屬植物，2000年版中國藥典收載了兩種藁本，即中國藁本（Ligusticum sinensis Olive）和遼藁本（Ligusticum jeholense Nakai et Kitagawa），根及根莖入藥。中國藁本主產于陜西、湖南、湖北、甘肅等??；遼藁本主產于河北、遼寧、內蒙古等省。具有抑菌、散風寒、祛濕止痛的功效。藁本中化學成分以內酯

3、類、酚酸類化合物為主，藁本水煎液及中性油具有抑菌、抗炎、解熱、鎮痛等多種作用?！熬盼濉逼陂g，我們參加了科技部攻關項目“中藥復方藥物標準化（范例）研究-藁本子課題，對中國藁本和遼藁本的化學成分進行了深入研究，共分離得到14個化合物；根據藁本的功效主治，設計了抗炎、鎮痛、鎮靜及抗血栓形成的藥效學實驗，并對藁本粗提物及單一成分進行了試驗，結果表明，藁本粗提物具有明顯的抗炎、鎮痛、鎮靜作用，阿魏酸抗炎作用不明顯，但鎮痛、鎮靜作用明顯而且對ADP誘導的大鼠體內血小板凝聚具有抑制作用。根據藁本中分離出的主要成分及藥效學實驗結果，我們先后建立了藁本中3種有效成分（阿魏酸、藁本內酯、藁本酚）的HPLC分析方法

4、，對20個不同產地藁本藥材的分析結果表明，阿魏酸是能夠代表藁本功效主治的主要活性成分，可以作為控制藁本藥材質量的定量指標。以阿魏酸作為含量測定標準品，藁本內酯作為鑒別成分，我們所建立的藁本質量控制方法被2000年版中國藥典采用。為了進一步了解藁本藥材在生物體內的生物轉化過程，我們首先對其主要有效成分阿魏酸進行體外及體內生物轉化研究，為進一步進行中藥材的生物體內過程研究奠定基礎。二、 阿魏酸在大鼠體外及體內代謝研究策略以Wistar種雄性大鼠作為研究對象，采用苯巴比妥鈉誘導大鼠肝微粒體溫孵體外代謝模型結合體內代謝研究方法， 闡明阿魏酸在大鼠體內的代謝產物結構，阿魏酸在大鼠體內代謝、排泄途徑及組織

5、分布情況。具體實驗設計如下：1、 以Wistar種雄性大鼠作為研究對象，體重200g左右。2、 以苯巴比妥鈉誘導大鼠，制備大鼠肝微粒體。3、 對阿魏酸進行大鼠體外肝微粒體溫孵體系中代謝研究，并對大鼠體外肝微粒體溫孵體系進行優化。4、 在優化的大鼠體外肝微粒體溫孵體系中進行大量阿魏酸的體外代謝，制備代謝物并進行結構鑒定。5、 進行阿魏酸大鼠體內代謝研究，給藥方式：口服灌胃。給藥劑量：200mg/kg體重。6、 藥物溶解方式：阿魏酸以生理鹽水溶解，1NaOH調pH至8.5，TWEEN-80助溶，濃度為50mg/ml，攪拌成澄清的溶液。4、 生物樣品收集：大鼠(n=4)在給藥前均禁食12小時，以含5

6、%蔗糖的生理鹽水維持，同時收集空白尿和糞。給藥后收集0-12小時及12-24小時尿和糞。大鼠(n=3)禁食12小時后，做膽汁引流手術，觀察3小時，同時收集空白膽汁，然后口服灌胃給藥，收集0-12小時及12-24小時膽汁。大鼠（n=3）禁食12小時后，給藥，1.5小時后，斷頭取血，同時取大鼠的心、肝、脾、肺、腎。5、 建立阿魏酸在大鼠體內代謝的生物樣品前處理方法。6、 建立阿魏酸在大鼠體內代謝的生物樣品的HPLC-DAD分析方法，初步確定主要代謝物。7、 通過主要代謝物的HPLC-MS及代謝物制備來進一步確定主要代謝物的結構。8、 研究阿魏酸在大鼠體內的分布情況。9、 推斷阿魏酸在大鼠體內的代謝

7、及排泄途徑。三、儀器設備及實驗材料1、 儀器設備Waters 2690 996 PDA HPLC儀；HPLC Agilent 1100, MS PE SCIEX QSTAR HPLC-MS聯用儀；Heidolph Diax 900 勻漿機；北京醫用離心機廠制造LD5-2A離心機；北京市長風儀器儀表公司電熱恒溫水浴箱。2、 動物Wista種，大鼠，體重200g左右。3、 藥品及試劑阿魏酸一部分由植化室陳若蕓教授提供，一部分購自中檢所，純度達97%以上；乙腈：Fisher色譜純；水：二次重蒸水；乙酸乙酯，北京化工廠，分析純；乙醚，北京化工廠，分析純；甲醇：北京化工廠，優級純；TWEEN-80,MU

8、NCHEN,German；氯化鈉注射液：山東臨淄制藥廠；蔗糖：北京化工廠，分析純；氯化鎂，北京市紅星化工廠，分析純；無水碳酸鈉，北京劉李店化工廠，分析純；苯巴比妥鈉（PB），北京芳草醫藥研制公司，化學純；氧化型輔酶（NAD），還原型輔酶（NADH），6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-P DH）；6-磷酸葡萄糖（G-6-P）均購自Sigma。四、研究結果（一）阿魏酸在大鼠體外肝微粒體溫孵體系的代謝研究大鼠體外肝微粒體溫孵代謝體系是一種簡單有效的制備氧化和還原型代謝產物的方法，而且雜質干擾少，易于代謝物的制備，因此首先進行了阿魏酸的體外代謝研究。1、 大鼠肝微粒體制備 Wistar種雄性大鼠，體重20

9、0g，腹腔注射PB生理鹽水，60mg/kg,連續三天，每天1次，最后一次注射禁食24小時后，斷頭處死，將血放盡，迅速剖腹，從門靜脈用冰冷生理鹽水灌洗肝臟至土灰色，摘取肝臟，生理鹽水漂洗，濾紙吸干，稱重，于2倍Tris-HCl PH7.4 緩沖液中剪碎，勻漿，勻漿液于10，000g離心30min，取上懸液于105，000g離心60min，取沉淀，每g肝與1ml 0.25 mol/L蔗糖溶液研磨成均勻混懸液，得微粒體溶液，于-20保存，上述操作均在冰浴中進行。用Lowry法測定蛋白含量，微粒體蛋白含量為27mg/ml。2、 大鼠體外肝微粒體溫孵代謝體系的選擇鑒于阿魏酸的結構，預計其一相代謝轉化以苯

10、環上的氧化反應為主，因此采用有氧代謝體系，具體設計見Tab.3-1具體操作：阿魏酸用TWEEN-80助溶于pH 7.4 的Tris-HCl 中，濃度為5mg/ml，取阿魏酸溶液0.2ml，然后依次按Tab3-1中量，加入NADP，NAD，G-6-P，G-6-P DH，MgCl2混勻，然后加入微粒體，以pH 7.4 的Tris-HCl補足體積至5ml，在37水浴中搖勻2分鐘。繼續在37水浴中溫孵，每15min通O2 30s。1.5hr后，撤離水浴，終止反應。1-6反應體系采用3×5ml乙酸乙酯提取，7采用3×5ml乙醚提取，8采用10倍甲醇提取。1-7合并有機層，無水Na2S

11、O4干燥過夜，40蒸干，殘渣溶于甲醇中，3500r/min離心，上清液進行HPLC分析。8加入10倍甲醇后，振搖2min后，3500r/min離心，上清液蒸干，殘渣溶于甲醇中，3500r/min離心，上清液進行HPLC分析。 Tab. 3-1 Incubation systems with liver microsomes and cofactor solutions No. microsomes protein NADP NAD G-6-P DH G-6-P Mg2+ Ferulic Acid mg mmol mmol IU mmol mmol mg 1 10 0.005 0.005 5 0

12、.05 0.02 1 2 10 0.005 0.0025 5 0.05 0.02 1 3 10 0.005 0.005 5 0.05 0.02 0.5 4 10 0.005 - 5 0.05 0.02 1 5 10* 0.0025 0.0025 5 0.05 0.02 - 6 10* 0.005 0.005 5 0.05 0.02 1 7 10 0.005 0.005 5 0.05 0.02 1 8 10 0.005 0.005 5 0.05 0.02 1Microsomes was heated at 100 for 10 min before use.3、 體外代謝樣品的HPLC-DAD分

13、析（1） 分析條件儀器： Waters 2690, 996 PDA；Phenomenex ODS 5um，4.6×250mm 色譜柱，檢測波長：320nm；流動相：水（含0.1%冰醋酸） ：乙腈 = 81 ：19（2）分析結果：分析結果見Fig.1， 為1號代謝體系的HPLC色譜圖，阿魏酸在所設計的上述大鼠體外肝微粒體溫孵體系中不代謝，按照上述實驗方案，又重復試驗一次，結果一致，因此得出結論，阿魏酸在PB誘導的大鼠體外肝微粒體溫孵體系中不發生氧化或還原型代謝轉化。 Fig.1 HPLC chromatogram of the incubate extract of ferulic a

14、cid under No.1 incubation condition( the detail see Tab.3-1)（二）阿魏酸在大鼠體內代謝的生物樣品前處理方法的摸索及HPLC-DAD分析方法的建立阿魏酸在PB誘導的大鼠體外肝微粒體溫孵體系中不代謝，因此進行其大鼠體內代謝研究，以口服灌胃給藥，收集尿、糞、膽汁，研究阿魏酸在大鼠體內代謝產物，闡明代謝及排泄途徑和組織分布情況。首先要解決的問題是建立簡便、可行、提取率高的生物樣品前處理方法及HPLC分析方法。1、 生物樣品前處理方法的摸索以Wistar種雄性大鼠作為研究對象（n=3），禁食12小時后，灌胃給藥，收集24小時內的尿、糞、膽汁。以

15、0-12小時的尿作為選擇生物樣品前處理方法的研究對象，取相同體積0-12小時的尿液進行甲醇提取、ODS固相萃取及尿液pH調至3.5左右后以甲醇提取、乙酸乙酯提取及ODS固相萃取，得到的樣品，經HPLC分析表明尿液pH調至3.5左右后ODS固相萃取對代謝物及原藥的提取率高，而且干擾相對少，但尿液直接進行ODS固相萃取，則對原藥提取率很低，但對代謝物提取率較高，而且雜質干擾很少。為了對阿魏酸在大鼠體內代謝作全面了解，我們選擇尿液pH調至3.5左右后ODS固相萃取做為樣品前處理方法，每ml樣品使用50mgODS，ODS以濕法裝柱，先以甲醇沖洗，接著用pH3.5的二次重蒸水洗柱，然后上樣品溶液，具體操

16、作見下圖： ODS 等體積pH3.5水洗 等體積水洗 等體積甲醇洗 蒸干 甲醇溶解 離心尿(pH 3.5） 甲醇液 殘渣 上清液 HPLC分析 ODS膽汁（pH 3.5） 同上 1 ：10水研磨 離心 ODS糞 上清液 同上 pH3.52、 HPLC-DAD分析方法的建立采用Phenomenex ODS 5um， 4.6X250mm 色譜柱，試驗了甲醇水（含0.1%冰醋酸）體系及乙腈水（含0.1%冰醋酸）體系，乙腈水（含0.1%冰醋酸）體系有利于阿魏酸及其代謝物的分析，經過流動相恒組成及梯度洗脫程序的選擇，確定阿魏及其代謝物在生物樣品中的分析方法如下：儀器： Waters 2690, 996

17、PDA檢測波長：320nm梯度洗脫程序： 乙 腈 水（含0.1%冰醋酸） 1.005.00min 16 84 5.0020.00min 24 76 20.0030.00min 40 60 30.0040.00min 16 84 每兩個樣品分析間隔時間：5min。（三）阿魏酸在大鼠體內代謝的生物樣品的HPLC-DAD分析1、生物樣品收集Wistar種雄性大鼠，禁食12小時后，灌胃給藥，收集0-12小時及12-24小時尿、糞及膽汁。然后按照上述生物樣品前處理方法進行處理，然后進行HPLC分析。2、生物樣品HPLC-DAD分析 0-12小時及12-24小時尿、糞及膽汁的HPLC-DAD分析結果見Fig.2至Fig.7，通過與空白對照及與原藥UV圖相似性的比較，表明阿魏酸在大鼠體內的代謝轉化率不高，主要以原藥形式從尿