1、DC -CIK 細(xì)胞臨床制備規(guī)范化研究張志偉,宋鑫(昆明醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院云南省腫瘤醫(yī)院生物治療中心,云南昆明650118A Study on Standardization of Culture of DC -CIK Cells for Clinical ApplicationZHANG Zhi -wei,SONG Xin摘要:樹突狀細(xì)胞(DC 與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK 共培養(yǎng),具有顯著的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng),逐漸成為腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療的首推方案。DC -CIK 的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)不僅在體外實(shí)驗(yàn)得到了證實(shí),而且臨床試驗(yàn)也證實(shí)了DC -CIK 的強(qiáng)大抗腫瘤效應(yīng)。然而目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于DC

2、 -CIK 細(xì)胞制備的統(tǒng)一技術(shù)規(guī)范,為此我們結(jié)合國內(nèi)外知名實(shí)驗(yàn)室的制備經(jīng)驗(yàn),對DC -CIK 細(xì)胞制備的技術(shù)規(guī)范進(jìn)行探討,以保證其臨床應(yīng)用的質(zhì)量和安全。關(guān)鍵詞:腫瘤免疫治療;樹突狀細(xì)胞;細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞;規(guī)范化中圖分類號:R730.51文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1004-0242(201102-0085-04DC -CIK 細(xì)胞因其高效的殺瘤效應(yīng),逐漸成為腫瘤過繼性細(xì)胞免疫治療的最佳方法之一。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells ,DC是目前已知功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,成熟DC 細(xì)胞可有效的誘導(dǎo)抗原特異性T 細(xì)胞增殖和活化,是機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要啟動(dòng)者和參與者1,2。細(xì)胞因

3、子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine -in -duced killer cells ,CIK ,是單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激產(chǎn)生的一群以CD3+CD56+細(xì)胞為主的異質(zhì)細(xì)胞,其兼有T 細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性與NK 細(xì)胞的非MHC 限制性殺瘤特點(diǎn)3,4。DC 和CIK 共培養(yǎng),具有顯著的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。M 覿rte 等5研究發(fā)現(xiàn),負(fù)載腫瘤抗原的DC 能提高CIK 的殺瘤特異性,同時(shí)CIK 能促使DC 表面共刺激分子表達(dá)增加,提高其抗原提呈能力。令人振奮的是,臨床試驗(yàn)顯示:DC -CIK 細(xì)胞過繼免疫治療對于非小細(xì)胞肺癌和骨肉瘤患者均有很好的臨床療效6,7。然而目前國內(nèi)外還沒有關(guān)于DC -CIK 細(xì)

4、胞制備的統(tǒng)一技術(shù)規(guī)范,為此我們結(jié)合國內(nèi)外知名實(shí)驗(yàn)室的制備經(jīng)驗(yàn),對DC -CIK 細(xì)胞制備的技術(shù)規(guī)范進(jìn)行探討,以保證其臨床應(yīng)用的質(zhì)量和安全。1DC -CIK 細(xì)胞制備的基本條件我們參考國家食品藥品監(jiān)督管理局2003年制訂的人體細(xì)胞治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則、衛(wèi)生部2009年制訂的第三類醫(yī)療技術(shù)管理規(guī)范自體免疫細(xì)胞(T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞治療技術(shù)管理規(guī)范和美國FDA 1998年制訂的人體細(xì)胞治療和基因治療指導(dǎo)原則,同時(shí)結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的DC -CIK 細(xì)胞制備經(jīng)驗(yàn),對DC -CIK 細(xì)胞制備的基本條件制訂如下規(guī)范。1.1臨床科室和細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室具有與自體免疫細(xì)胞治療相對應(yīng)的臨床科室,科室人員組成

5、包括有與開展人體免疫細(xì)胞治療技術(shù)相適應(yīng)的執(zhí)業(yè)醫(yī)師、執(zhí)業(yè)護(hù)士、具有免疫學(xué)專業(yè)背景的專家和自體免疫細(xì)胞制備的技術(shù)人員;具備開展自體免疫細(xì)胞治療技術(shù)的場地、設(shè)備和設(shè)施;具備從事自體免疫細(xì)胞治療質(zhì)量控制的專業(yè)檢驗(yàn)科室和人員。細(xì)胞制備中心主要由血細(xì)胞采集室、細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室和細(xì)胞質(zhì)量檢測室三部分構(gòu)成,其中細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備省級以上藥品監(jiān)督管理部門和疾病預(yù)防控制收稿日期:2010-07-15基金項(xiàng)目:國家教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCET -08-0923;國家自然科學(xué)基金(30760014,81060185;昆明市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(昆科07S060202;云南省科技廳昆明醫(yī)學(xué)院聯(lián)合基金(2007

6、C0022R ;云南省科技廳科技創(chuàng)新強(qiáng)省國際合作專項(xiàng)(2009AC016。通訊作者:宋鑫E -mail:songxin68中心認(rèn)證的GMP制備室;有細(xì)胞采集、加工、檢定、保存和臨床應(yīng)用全過程的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(stan-dard operation procedure,SOP和完整的質(zhì)量管理記錄;制定并遵循GMP實(shí)驗(yàn)室維護(hù)標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP;遵循細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)并擁有與其配套的檢測設(shè)備和檢測方法。1.2人員配置臨床科室應(yīng)有10年以上開展細(xì)胞技術(shù)臨床應(yīng)用相關(guān)專業(yè)臨床診療經(jīng)驗(yàn),具有副主任醫(yī)師及以上專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格,經(jīng)過衛(wèi)生行政部門認(rèn)可的自體免疫細(xì)胞治療技術(shù)系統(tǒng)培訓(xùn)并考核合格的自體免疫細(xì)胞治療

7、醫(yī)師。血細(xì)胞采集室應(yīng)有護(hù)理專業(yè)大學(xué)(專本科及以上學(xué)歷,經(jīng)專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)并考試合格的執(zhí)業(yè)護(hù)士。細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室至少有1名副高級以上專業(yè)技術(shù)職務(wù)任職資格的總體負(fù)責(zé)人,從事細(xì)胞制備的操作人員具有相關(guān)專業(yè)(生物、免疫、檢驗(yàn)和醫(yī)學(xué)大學(xué)(專本科及以上學(xué)歷,有不少于50例實(shí)驗(yàn)性免疫細(xì)胞制備經(jīng)驗(yàn),經(jīng)過細(xì)胞制備相關(guān)專業(yè)系統(tǒng)培訓(xùn)并考核合格。細(xì)胞質(zhì)量檢測室應(yīng)有檢驗(yàn)相關(guān)專業(yè)大學(xué)(專本科及以上學(xué)歷,經(jīng)專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)并考試合格的專業(yè)檢驗(yàn)人員。1.3材料和試劑血細(xì)胞采集的管道和相關(guān)材料必須保證一人一套,防止交叉感染和其它不良反應(yīng)。DC-CIK細(xì)胞制備試劑要求:細(xì)胞制備過程中使用的細(xì)胞培養(yǎng)成分和添加物(培養(yǎng)液、細(xì)胞因子、血清等以及

8、制備過程所用的耗材,其來源和質(zhì)量認(rèn)證,應(yīng)符合臨床使用的質(zhì)量要求;分離、純化細(xì)胞產(chǎn)品所需試劑和器械均必須經(jīng)食品藥品監(jiān)督管理部門審批,具有臨床應(yīng)用的許可證;一次性耗材不能重復(fù)使用;使用經(jīng)藥品監(jiān)督管理部門審批的醫(yī)用物品和耗材,建立登記制度,保證來源可追溯。1.4細(xì)胞制備質(zhì)量控制細(xì)胞質(zhì)量指標(biāo):每批細(xì)胞應(yīng)注明來源并加以標(biāo)記或確定批號;細(xì)胞數(shù)量應(yīng)滿足臨床最低需求,存活率應(yīng)不低于80%;純度和均一性達(dá)到臨床應(yīng)用水平;體外檢測細(xì)胞具備正常功能和生物學(xué)效應(yīng),如細(xì)胞具有的某種生物學(xué)功能,分泌某種產(chǎn)物的能力,表達(dá)某種標(biāo)志的水平等。細(xì)胞制品外源因子的檢測包括:細(xì)菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素。參照現(xiàn)行版中國藥典生物制品相關(guān)

9、規(guī)程進(jìn)行。無菌試驗(yàn):每批培養(yǎng)的細(xì)胞在患者輸注前均應(yīng)進(jìn)行無菌試驗(yàn)。建議在培養(yǎng)開始后34d起每間隔一定時(shí)間取培養(yǎng)液樣品,包括患者回輸前48h取樣,按現(xiàn)行版中國藥典生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。在患者使用前,取培養(yǎng)液及/或沉淀物用丫啶橙染色或革蘭染色,追加一次污染檢測。進(jìn)行長期培養(yǎng)的細(xì)胞,應(yīng)進(jìn)行支原體檢查。對每一批細(xì)胞終制劑應(yīng)留樣檢測。如果留樣發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,應(yīng)及時(shí)對生產(chǎn)過程進(jìn)行檢查。如果在細(xì)胞制備的早期發(fā)現(xiàn)有污染的情況,應(yīng)終止該批細(xì)胞制品的繼續(xù)制備。細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有自體DC-CIK細(xì)胞制備及檢定過程的原始記錄和檢定報(bào)告,并永久保存。2DC-CIK細(xì)胞的制備流程通過與國內(nèi)外多家知名腫瘤生物治療中心交流

10、和合作,結(jié)合各中心DC-CIK細(xì)胞的制備經(jīng)驗(yàn),我們生物治療中心對DC-CIK細(xì)胞的臨床制備流程進(jìn)行了深入探討并制訂出如下規(guī)范(流程見圖1。2.1采血前檢查患者在進(jìn)行血細(xì)胞采集之前,必須經(jīng)過檢驗(yàn)證明肝炎病毒(HAV、HBV、HCV、HDV和HEV、HIV-1/2、梅毒螺旋體及寄生蟲感染等均為陰性,同時(shí)還要排除自身免疫性疾病(如慢性淋巴性甲狀腺炎、潰瘍型結(jié)腸炎、重癥肌無力、多發(fā)性硬化病、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合 征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和混合型結(jié)締組織病等,必要時(shí)需說明患者自體的血清學(xué)、診斷學(xué)及臨床資料。2.2外周血單個(gè)核細(xì)胞采集無菌條件下,由專職人員使用血

11、細(xì)胞分離機(jī)采集患者自體外周血單個(gè)核細(xì)胞8(peripheral blood mononuclear cell,PBMC,細(xì)胞數(shù)量達(dá)到(13×108以上,必須保證一位患者一套采集管道。2.3腫瘤抗原的制備手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本,無菌條件下,將癌旁非腫瘤組織去除干凈,浸于PBS溶液中;然后用手術(shù)刀將組織塊切碎,浸于包含0.5mg/ml型膠原酶和75U/ml 型DNA酶的消化液中,37孵育30min,收集細(xì)胞;細(xì)胞經(jīng)過液氮和37溫箱反復(fù)凍融5個(gè)循環(huán),收集細(xì)胞裂解物并通過0.2m 濾器過濾,-80保存?zhèn)溆?。腫瘤細(xì)胞裂解物采用BCA法測定蛋白濃度。2.4DC細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定收集的PBMC重懸于無

12、血清培養(yǎng)基中,置于37,5%CO2培養(yǎng)箱孵育2h,去除非貼壁細(xì)胞,加入rhGM-CSF1000U/ml和rhIL-4500U/ml,刺激細(xì)胞向DC 細(xì)胞分化10,11;根據(jù)生長情況每23d進(jìn)行一次半量換液;在培養(yǎng)的第5d,加入腫瘤抗原裂解物50g/ml9,刺激抗原特異性的DC 細(xì)胞產(chǎn)生;在培養(yǎng)的第6d,加入IL-1,IL-6和TNF等細(xì)胞因子12,13,刺激DC細(xì)胞成熟;在第7d,收獲DC細(xì)胞,其數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×106個(gè)以上,臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力應(yīng)在80%以上,流式細(xì)胞儀檢測DC細(xì)胞免疫表型CD11c、HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD83和CD86等的表達(dá),成熟

13、的DC高表達(dá)這些表面標(biāo)記14,15。2.5CIK細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定收集的PBMC重懸于無血清培養(yǎng)基中,置于37,5%CO2條件下孵育2h,收集非貼壁細(xì)胞,加入1000U/ml的IFN-培養(yǎng)16,24h后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和500U/ml的rhIL-217,18,刺激CIK細(xì)胞的生長和增殖;根據(jù)生長情況每23d進(jìn)行一次擴(kuò)瓶傳代培養(yǎng);在第7d,收獲CIK細(xì)胞,其數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×109個(gè)以上,臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力應(yīng)在80%以上,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞免疫表型HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD45和CD56等的表達(dá)19,20,其中CD3+CD56+的細(xì)胞應(yīng)達(dá)到20%以上

14、。2.6DC-CIK細(xì)胞的制備和質(zhì)檢收集培養(yǎng)第7d的DC細(xì)胞及CIK細(xì)胞按110比例共培養(yǎng)7,繼續(xù)培養(yǎng)7d;在培養(yǎng)結(jié)束前,取樣進(jìn)行無菌試驗(yàn)檢測,確認(rèn)檢測結(jié)果陰性后,在第14d收集細(xì)胞,其數(shù)量應(yīng)達(dá)到1×1010個(gè)以上,臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力應(yīng)在80%以上,同時(shí)采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞免疫表型HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD11c、CD40、CD45、CD56、CD83、CD80和CD86等的表達(dá);在患者使用前,取培養(yǎng)液用丫啶橙染色或革蘭染色,追加一次污染檢測。此外,對每一批細(xì)胞終制劑均要留樣檢測。3結(jié)語DC-CIK細(xì)胞過繼性免疫治療因其高效的殺瘤活性,被認(rèn)為是最

15、有前途的腫瘤免疫治療手段之一。DC與CIK共培養(yǎng),構(gòu)成了一個(gè)體外活化免疫體系,回輸后能夠有效地抵抗癌細(xì)胞對免疫細(xì)胞的抑制作用,發(fā)揮更持久的殺瘤活性,是主動(dòng)特異性免疫治療和過繼免疫治療相結(jié)合的典范。初步的臨床試驗(yàn)證實(shí)了DC-CIK的安全性和有效性,但是其具體作用機(jī)制和長期療效仍需進(jìn)一步研究。隨著DC-CIK細(xì)胞過繼性免疫治療的規(guī)范化和臨床應(yīng)用發(fā)展,DC-CIK細(xì)胞必將成為新一代過繼細(xì)胞免疫治療的最佳方法之一。參考文獻(xiàn):1Sabado RL,Bhardwaj N.Directingdendritic cell immunotherapy towardssuccessful cancer treat

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