1、生物工藝學實驗實驗指導（適用生物工程專業）屈慧鴿 馮志彬 程仕偉編寫魯東大學生命科學學院實驗一 呼吸缺陷型酵母菌株的誘變選育一、實驗目的1、理解呼吸缺陷性酵母的篩選原理；2、掌握呼吸缺陷性酵母的篩選步驟。二、實驗原理部分酵母菌在一定的物理（如紫外線）或化學誘變劑作用下發生基因突變而喪失呼吸能力，呼吸缺陷性酵母菌株即為喪失呼吸能力的突變株，其對非發酵型底物如甘油、酒精、醋酸等不能氧化，但CO2放出高于對照株，酒精脫氫酶活力也較對照高出1倍左右，對提高酒精產率有好處。同時，呼吸缺陷型也是育種工作可利用的一個有效的遺傳標記。三、實驗材料1.菌株：酒精酵母2.培養基CM培養基：葡萄糖 40g MgSO

2、4 2g蛋白胨 10g 瓊脂 18g酵母膏 5g 水 1000mlKH2PO45g不加瓊脂即為液體CM，分裝20ml于250ml三角瓶中。TTC上層培養基葡萄糖5g TTC（紅氮四唑）0.5 g瓊脂 10g 水 1000ml 分裝，121滅菌 15min。TTC下層培養基葡萄糖 10g MgSO4 7H2O0.4g蛋白胨 2g 瓊脂 18g酵母膏 5g 水 1000mlKH2PO41g pH 5.55.7MM甘培養基酵母膏6.7g 甘油 20ml水 980ml pH 5.5瓊脂粉 18g分裝，121滅菌 10min。3、儀器設備紫外誘變箱、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養箱四、操作步驟1、培養

3、基配制：配制實驗過程中所需全部培養基并準備誘變及篩選所需的移液管、試管、平板等物品，121滅菌20min，其中TTC上層板培養基滅菌后備用，無需倒平板；2、菌種活化：取活化后的酵母菌1環，接入到三角瓶中液體CM培養基，200r/min、30振蕩培養過夜；3、菌懸液制備：將培養好的酵母細胞4000r/min離心洗滌3次，調整細胞濃度為106/ml備用，實驗過程無菌操作；4、誘變：取15-20ml菌懸液于滅菌空白平板內，磁力攪拌器轉速為30r/min，調整與紫外燈管距離為20cm，開蓋照射45-75s，蓋上蓋誘變結束；5、稀釋涂布：將誘變后的菌懸液梯度稀釋至10-6，于CM平板涂布，避光培養24-

4、36h，選擇菌落個數合適的平板備用；6、點接：將CM培養基平板上長出的菌落點種TTC下層平板上，30培養24-48h；7、鑒定：將TTC上層培養基溶化并冷卻（不燙手）后，小心傾入TTC上層培養基上，使其剛好掩埋菌落。等凝固后，30培養23h。此時，平板菌落顏色會區分成紅色、粉紅色和白色。呼吸缺陷型突變株為白色菌落。8、復檢：用無菌牙簽將在TTC鑒別培養基上生長的白色小菌落分別點種到MM甘培養基和CM培養基上。注意點種時，先點MM甘培養基，后點種CM培養基，并在平皿上做好標記。30培養24h觀察實驗結果。五、實驗結果分析1、描述實驗結果計算呼吸缺陷性酵母突變率，并分析實驗過程中影響誘變效果的因素

5、；2、對比并參照其他小組實驗結果，評價本小組實驗過程中的利害得失六、數據分析突變率：平板計數法七、思考題1、分析呼吸缺陷型突變株為白色菌落為白色，其它菌株紅色、粉紅色的機理。2、呼吸缺陷性酵母篩選工作有何現實意義？3、如果白色小菌落分別點種到MM甘培養基和CM培養基上培養后都有生長，討論有哪些原因？實驗二 紅曲發酵及紅曲色素的提取一、實驗目的1、了解紅曲菌液體菌種的制備方法, 為紅曲發酵實驗準備液體種子。2、了解固體發酵的工藝過程 , 在實驗室中小規模制備紅曲。3、熟悉從紅曲中分離代謝產物的方法，以及掌握紅曲色素色價的測定方法。二、實驗原理 紅曲霉菌屬真菌界(Eumycophyta)、子囊菌門

6、(Ascomycota)、真子囊菌綱(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、紅曲菌科(Monascaceae)、紅曲菌屬(Monascus)。由紅曲霉接種于大米發酵得到的紅曲是我國古代的一大發明，稱為丹曲，至今已有1000多年的歷史，很早就應用于食品著色、食品發酵以及中醫中藥。紅曲霉作為紅曲的生產菌, 以其可產生大量天然色素而著稱。紅曲的應用主要有三方面：食品色素、藥物和發酵食品。紅曲色素是紅曲霉在生長代謝過程中產生的天然色素，是紅曲霉的次生代謝產物，具有熱穩定性好，蛋白著色力強，色調柔和，可以提高加工制品對光和氧穩定等優點；而且紅曲色素無毒性、無致突變作用，安全性

7、很高，因此紅曲可提供安全性高的天然色素。紅曲色素分為黃色素、橙色素和紫紅色素，其中黃色素包括紅曲素(Monascin)和黃紅曲素(Ankaflavin)，橙色素包括紅斑紅曲素(Rubropunctatin)和紅曲玉紅素(Monascorubin)，紫紅色素包括紅斑紅曲胺(Rubropunctamine)和紅曲玉紅胺(Monascoru- bramine)。凡色素的呈色都與其結構有著密切的關系，結構的形式與變化內在決定著物質的呈色與變色。大米經紅曲菌固體發酵后產生了一系列紅曲菌的代謝產物, 但這些產物的量非常少, 大米仍占固體發酵產物的絕大部分體積, 為了降低運輸成本, 常常要對紅曲菌的代謝產物

8、進行提取和濃縮。紅曲的代謝產物中既有水溶性組分, 也有脂溶性組分, 因此可用 80% 的丙酮(丙酮:水 =80：20)抽提。用 HCl 或 NaOH 處理可以將其中的酸溶性組分、堿溶性組分和中性組分分開。選擇溶劑一般要注意以下四點： 溶劑對所需成分的溶解度要大，對雜質溶解度要小，或反之。 溶劑不能與天然藥物成分產生化學反應，即使反應亦屬于可逆性的。 溶劑要經濟易得，并具有一定的安全性。 沸點宜適中，便于回收反復使用。紅色素能溶于80% 的乙醇中 , 可通過萃取從米粒中提取出來, 紅曲色素在505nm 處有最大的吸收峰, 可用分光光度計來測定。三、實驗器材與試劑1菌種：紅曲50032培養基玉米面

9、液體培養基（g/L）：蛋白胨 20；玉米面 20；酵母浸粉 10；硫酸鎂0.5；磷酸氫二鉀 1；硫酸亞鐵 0.1；pH 6.0。發酵培養基：大米培養基3、儀器與設備恒溫搖床, 超凈工作臺, 高壓蒸汽滅菌鍋、旋轉蒸發儀、恒溫培養箱等。四、實驗步驟1、紅曲液體種子制備：配制制玉米面液體培養基。500mL 三角瓶中裝玉米面液體培養基 150mL, 包扎后 0.lMPa 滅菌 20 分鐘；玉米面液體培養基滅菌冷卻后 , 每瓶中接入 1/4支紅曲斜面菌苔 ( 注意無菌操作 )；接種后置30恒溫搖床中180 rpm 搖瓶培養3天。2、固體培養基制備及接種1）浸米 :25 以上浸米 58h, 大米吸收水分約

10、在 28%30% 。2）蒸米: 將浸好的米用清水淋去米漿水, 瀝干, 即可蒸米。上汽火力要強, 待全部圓氣以后，蒸煮35min, 出飯率在 135%, 飯粒呈玉色, 粒粒疏松, 不結團塊。蒸米不能熟透。3）攤涼接種: 將蒸熟的曲料倒在超凈工作臺上迅速打碎團塊, 攤平冷卻到 3032 然后, 每1kg米接種液體種子20ml, 充分翻拌混合均勻,操作要迅速, 以減少雜菌污染。3、紅曲固態發酵: 將曲料攤在曲盤內, 厚度約3-5cm。3233 保溫保濕培養。每天翻曲一次，觀察到曲粒表面略有干皮、少數曲粒略有微紅斑點等現象時即可“吃水”, 使曲粒吸收一定水分, 以利菌絲逐漸向內生長。吃水方法: 一邊拌

11、曲，一邊向曲盤中噴灑無菌水, 使曲粒表面潤濕并微有發脹。培養3天后米粒逐漸成紅色。觀察記錄色素產生的過程。培養5-7天后，固態發酵結束的紅曲置于鼓風干燥箱內5060鼓風干燥。4、成品質量檢查外觀檢查 : 曲粒表層光滑紫紅, 曲粒中心呈玉色, 不得有空心和紅心。曲粒斷面菌絲均勻，具有紅曲特有的曲香, 不得有酸氣等不正常氣味。生物與理化項目檢查: 水分12%以下, 容量(l00mL)44.546.5g, 淀粉含量59-62%, 無細菌和其他霉菌污染。5、紅曲色素提取：1）取200g固體發酵之紅曲, 在植物粉碎機中將其粉碎；2）將紅曲粉放于500mL 三角瓶中, 加入提取液(丙酮 : 水 =80:2

12、0)300mL；3）室溫下浸提 1 天, 每隔 2 小時搖動一次, 過濾；4）沉淀用同樣提取液洗滌 2 次, 每次100ml, 合并濾液；5）在旋轉蒸發儀中減壓蒸去丙酮( 尚有水分 )；6）用 l mol/L HCl調殘留液(約 l00mL)的pH至3.0, 加至分液漏斗中；7）用 150mL 醋酸乙酯分次抽提；8）以同樣方法按下圖分離堿(溶)性組分、中性組分和酸(溶)性組分, 觀察各組分的顏色；9）將各分離到的組分在旋轉減壓蒸發儀中蒸去溶劑, 低溫保存。五 實驗結果分析1、根據實驗結果繪制紅曲色價生成曲線，分析影響紅曲色素合成的因素2、根據紅曲色素分離實驗結果描述紅曲色素組分及特性六、參數測

13、定紅曲色價測定：1）稱取紅曲米樣品0.5g, 放入帶有刻度的 lOmL 具塞試管中；2）加入 80%的乙醇 8mL, 搖勻,60水浴保溫萃取0.5h；3）取出冷卻, 用普通定性濾紙過濾入lOmL 量筒中, 用 80% 乙醇洗滌殘渣 2 次, 合并濾液, 并用 80% 乙醇定容至10mL；4）以 80% 乙醇作對照, 在 505nm 波長下, 用 lcm 比色皿測定樣品的吸光度。5）計算: 紅曲色價(以lg樣品計)=A505×lO×2注意：發酵后期, 若紅色素產生量多, 可稀釋后測定。七、注意事項 :1. 無水 Na2S04可回收, 反復使用, 不要扔掉。2. 有機溶劑易燃,

14、 注意遠離火源, 原則上應在通風柜中進行。八、思考題 :1比較固態發酵與液體發酵的優缺點，并指出固體發酵的應用范圍。2萃取后米粒中仍帶有紅色, 是否會對結果產生影響?附：紅曲代謝產物分離工藝流程圖實驗三蘇云金芽孢桿菌的培養及粉劑制備一、 實驗目的1、 學習蘇云金芽孢桿菌的種子制備、發酵生產和產品檢測的方法；2、 掌握蘇云金芽孢桿菌發酵生產的調控原理。二、 實驗原理蘇云金芽孢桿菌是內生芽孢的革蘭氏陽性土壤細菌，是應用最廣的一種微生物殺蟲劑，它的主要活性成分是一種或數種殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，又稱-內毒素，對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅

15、目、同翅目等昆蟲，以及動植物線蟲、蜱螨等節肢動物都有特異性的毒殺活性，而對非目標生物安全因此，Bt殺蟲劑具有專一、高效和對人畜安全等優點目前蘇云金桿菌商品制劑已達100多種，是世界上應用最為廣泛、用量最大、效果最好的微生物殺蟲劑，因而倍受人們關注。殺蟲伴孢晶體蛋白本身無毒，在酸性條件下會變性失去作用，對于人和哺乳動物，當它進入機體后，馬上在胃酸作用下變性，而在腔腸動物體內，沒有酸性環境，不會馬上變性，在堿性條件下馬上分解，釋放毒性蛋白，起到對集體的毒害作用。利用發酵法可實現蘇云金芽孢桿菌的大規模培養，最后加工成含有芽孢、伴孢晶體及其他毒素的粉劑。三、 實驗材料一） 設備發酵罐、搖床、顯微鏡、干

16、燥箱、高速離心機二） 菌種蘇云金芽孢桿菌三） 培養基(%)斜面培養基酵母粉 0.5，蛋白胨 1，NaCL 0.5，pH7.0種子培養基：葡萄糖 2，酵母浸粉 0.5，蛋白胨 0.5， K2HPO4 0.1，MgSO4 0.05，硫酸銨 0.5，pH7.0發酵培養基:葡萄糖 3，酵母浸粉 0.5，玉米漿 1，K2HPO4 0.1，MgSO4 0.05，硫酸銨 1，pH7.0四、實驗步驟1、斜面菌種制備：接種針挑取1環原始菌種，于斜面培養基劃線，在恒溫培養箱30培養24h；2、液體種子培養：挑取1環培養好的線面菌株，接種到含50ml液體種子培養基的500ml三角瓶中，在200r/min、30條件下

17、培養12h左右，待菌體OD凈增達到0.5以上時轉入發酵培養基；3、發酵罐培養：配置好發酵培養基，進行原位滅菌，待培養基溫度冷卻至30時按10%種量接入培養好的種子液，調節進氣和尾氣閥門維持罐壓在0.5Mpa以內，轉速200-700r/min，通氣量 0.8-6vvm，溶氧在20%以上，溫度30，pH7.0，過程中流加NaOH或氨水調節pH在7.0，培養至菌體濃度在20億/ml，90%菌體細胞形成內生芽孢時停止發酵；4、粉劑制備取一定體積發酵液于4000r/min離心機離心10min，棄上清取沉淀，于50-60干燥箱烘干即為蘇云金芽孢桿菌粉劑。五、實驗結果分析1、采用平板計數法計算發酵液菌體濃度

18、并利用細菌計數器計算芽孢形成率；采用平板計數法計算粉劑中芽孢數量,根據實驗結果分析影響菌體生長及芽孢形成的因素2、根據實驗結果繪制時間與還原糖、溶氧、轉速、通氣量、pH及菌體濃度的過程曲線，并解釋曲線變化的原因六、參數測定方法1、菌體OD：發酵液稀釋20倍，采用分光光度計于600nm測吸光值2、還原糖：斐林試劑法3、活菌計數：平板計數法七、思考題1、簡述蘇云金芽孢桿菌的殺蟲原理；2、利用發酵罐培養蘇云金芽孢桿菌過程中，溶氧對菌體生長有何影響。3、為了解發蘇云金芽孢桿菌發酵過程中二氧化碳濃度的變化，請設計實驗測定尾氣中二氧化碳濃度的方法，并說明實驗原理。附錄發酵液中還原糖的測定方法（亞鐵氰化鉀快

19、速法）1 試劑與溶液1.1 費林氏甲液稱取分析純硫酸銅(CuSO4·5H2O)15g及四甲基藍 (次甲基藍) 0.05g,用蒸餾水溶解, 定容至1000mL。1.2 費林氏乙液稱取分析純酒石酸鉀鈉50g，分析純氫氧化鈉54g及分析純亞鐵氰化鉀4g，用蒸餾水溶解，定容至1000mL。1.3 0.1%葡萄糖標準溶液精確稱取在105烘 23h至恒重的分析純無水葡萄糖1.000g,放入100mL燒杯中,用蒸餾水溶解,定容至1000mL,為防染菌,可加 5mL濃鹽酸后再定容。2 測定方法2.1 樣品處理及吸取吸取樣品10mL,用蒸餾水稀釋定容至100mL,搖勻吸取稀釋液 1mL進行測定。稀釋度及吸取量根據含糖量可予增減。2.2 空白滴定精確吸取費林試劑甲、乙液各5mL放入150mL錐形瓶中,加蒸餾水10mL。再用滴定管加入0.1%葡萄糖標準液9mL。搖勻，在電爐(或煤氣燈)上加熱,使其在2min內沸騰,沸騰30s后,勻速滴入0.1%葡萄糖標準液，至藍色消失即為終點。記錄沸騰前后共耗用葡萄糖液毫升數(A)。2.3 預備滴定精確吸取費林甲、乙液各5mL,放入150mL錐形瓶中,加蒸餾水10mL,再加1mL10