1、離子交換分離純化蛋白原理及應用離子交換劑基質主要有樹脂、纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和硅膠（HPLC）等離子交換樹脂一般只適合分離小分子物質如氨基酸等，不適合分離蛋白質等大分子物質，一方面是因為大分子不易進入樹脂緊密交聯結構的內部，另一方面因為交聯聚苯乙烯骨架疏水性很強，用于蛋白質分離時，會出現疏水性的不可逆吸附。此外，離子交換樹脂的機械強度較差，而且樹脂的體積常隨著溶劑離子強度的變化發生溶脹和收縮。 根據交換基團的電荷性質進行分類：陽離子交換樹脂： 強酸型 含磺酸基團 (R-SO3H) 中等酸型 含磷酸基團 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基陰離子交換樹脂： 強堿 含季胺基團

2、-N+(CH3)3 弱堿 含叔胺、伯胺基團-N(CH3)2 陰離子交換樹脂對化學試劑及熱都不如陽離子交換樹脂穩定。弱酸型只能在堿性pH范圍內使用 弱堿型只能在酸性pH范圍內使用離子交換纖維素的種類很多，可分為陰離子交換纖維素和陽離子交換纖維素兩大類。由于這些材料是纖維狀的，大部分活性基團分布在表面，所以，適合于分離蛋白質等生物大分子。陰離子交換纖維素 DEAE-纖維素,具二乙胺乙基，陽離子交換纖維素CM-纖維素,具有羧甲基，分別是應用得最廣泛的陰離子交換纖維素和陽離子交換纖維素。另外，根據纖維素顆粒的物理結構不同，可分為“纖維型”和“微晶型”兩大類。“微晶型”因顆粒細、比重大，能制成緊密的柱，

3、交換容量大，分辨率高。離子交換凝膠：離子交換葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠具有許多優點，分離大分子物質，不會引起被分離物質的變性戒失活，非特異性吸附很低；交換容量大(為離子交換纖維素的3-4 倍)；容易制成微球型，因此裝柱和層析時的流速都較易控制。它的缺點是隨著洗脫液的離子強度和pH 的變化，床體積變化大，明顯影響流速;另外,由于它的凝膠性質,有時會把大分子物質排阻在網絡結構之外。如：葡聚糖（Sephadex）、 聚丙烯酰胺（PAG）、瓊脂糖（Sepharose）平衡緩沖液：它的離子強度和pH的選擇首先要保證各個待分離物質如蛋白質的穩定。其次是要使各個待分離物質與離子交換劑有適當的結合。增強洗脫液

4、與離子交換劑的結合力，降低分離物與離子交換劑的結合力洗脫緩沖液：在離子交換層析中一般常用梯度洗脫，通常有改變離子強度和改變pH兩種方式。改變離子強度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強度，從而使與離子交換劑結合的各個組分被洗脫下來；而改變pH的洗脫，對于陽離子交換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH從高到低。由于pH可能對蛋白的穩定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強度的梯度洗脫。強酸性陽離子換劑H+的結合力比對Na+的小；H型SP Sepharose FF Nacl、NaOH、NH4OH、NH4Cl洗脫 磷酸緩沖液平衡弱酸性陽離子交換劑對H+的結合力遠比對Na+的大；Na型 CM

5、-纖維素NAOH或HCL H+或Na+洗脫強堿性陰離子交換劑對OH- 的結合力比對C1-的小得多；OH型弱堿性陰離子交換劑對OH- 的結合力比對Cl- 的大。 Cl型DEAE-纖維素Nacl、NaOH、乙酸銨（NH4Ac）、磷酸根（PO3-）洗脫 Tris-Hcl、磷酸鹽緩沖液平衡。陰離子交換劑堿性 堿性緩沖液 酸性蛋白 蛋白pI pH 時 帶負電陽離子交換劑堿性 酸性緩沖液 堿性蛋白 pI pH 時 帶正電DEAE-纖維 陰離子交換劑純化分離酸性蛋白 堿性緩沖液 CM纖維素 陽離子交換劑純化分離堿性蛋白 酸性緩沖液 堿性越強，就越容易被陽離子交換劑吸附 蛋白在pH58穩定時，則應選擇陰離子交

6、換劑；蛋白在pH5以下穩定時，則可選擇陽離子交換劑。陰離子交換劑，pH8.6以下分離中性或酸性物質。陽離子交換劑，一般pH>4條件下使用，DEAE-纖維素吸附酶和蛋白質時常用pH為79，然后提高鹽濃度或降低pH使之洗脫。CM纖維素常選在pH4.56.0左右吸附蛋白質，然后提高pH或鹽濃度進行洗脫。 例：用離子交換，那首先就要考慮是要陽離子還是陰離子，還有就是你的目的物的PH值蛋白質是pI=6.27 陰離子交換，用pH8.0-9.0的緩沖液 首先利用緩沖液PH值把目的蛋白給結合到柱子上，然后用合適的鹽離子洗脫下來。陰離子交換柱：上樣緩沖液20mM Tris-HCl，用00.5M NaCl梯度洗脫，流速約2ml/min。注意：首先是蛋白的等電點是多少選擇pH值，掛柱時pH盡量不要超過pI值的2個點。Nacl的濃度可以設梯度，平衡時用0.1mol之后可以選擇0.3 0