1、指南與共識】高通量宏基因組測序技術檢測病原微生物的臨床應用規范化專家共識摘要：宏基因組下一代測序（mNGS）技術直接針對標本中核酸無偏倚檢測病原微生物序列。但是，mNGS需經標本前處理、核酸提取、文庫制備、上機測序、數據庫比對、報告生成及結果解讀等一系列過程，對技術平臺及人員素質要求較高。為規范mNGS技術在感染性疾病診斷中的應用，提高危急重癥、疑難感染性疾病和新發突發傳染病的救治水平，在多項國家科技專項的支持下，本領域有關專家起草了本共識，以促進mNGS技術的規范應用和良性發展。快速準確的微生物鑒定技術始終是臨床微生物關注的焦點。傳統微生物檢驗，諸如形態學、培養、抗原抗體及靶向核酸檢測等方法

2、在解決疑難及未知病原微生物上存在局限性,1,2°新型宏基因組下一代測序（metagenomicsnext-generationsequencing,mNGS）技術直接針對樣本中所有核酸進行無偏性測序，結合病原微生物數據庫及特定算法，檢測樣本中含有的可能病原微生物序列。隨著該技術的社會經濟成本不斷降低和技術的不斷完善，已逐漸從科研走向臨床應用，成為臨床疑難和未知病原微生物檢驗的重要手段,3O利用mNGS技術進行病原微生物檢測需經樣本前處理、核酸提取、文庫制備、上機測序并滿足測試的質量控制要求后，采用特定算法軟件與專用的病原微生物數據庫進行比對，實現對病毒、細菌、真菌、寄生蟲及非經典微生

3、物等的檢測“4,5mNGS技術不依賴培養，對常見病原微生物檢驗陰性、經驗治療失敗、不明原因的危急重感染的病原學診斷以及新發突發傳染病的病原體發現具有獨特價值,6,7o為進一步規范mNGS技術在感染性疾病診斷中的應用，提高危急重癥和疑難感染性疾病的診療水平，在多項國家科技專項的支持下，參考國內外相關文獻、共識與規范8,9,o11,12,13,14,15,特別借鑒了高通量測序技術臨床檢測規范化應用北京專家共識（第一版通用部分）,16:組織本領域有關專家起草了本共識，以促進mNGS技術的規范應用和良性發展。本共識中聲明的內容為專家討論并推薦的要點。一、臨床應用的基本要求(一)適應證基于醫學決策的mN

4、GS病原微生物檢測申請，一般用于傳統檢驗方法未能給出明確病原學結果從而影響患者準確診療的感染性疾病、新發突發傳染病、驗證常規檢驗結果或排除其他發熱疾病。推薦臨床通過擬診先行傳統微生物檢驗及聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)檢測擬診疑似常見病原微生物，不盲目使用mNGS技術。在必要或緊急情況下，如危急重癥、疑難感染、群體性感染事件等，可考慮作為一線檢測方法。表1列出了mNGS臨床應用適應性說明。中醫尸尸：祖巧宸件總昕.LKUMIilASTTEHlTlflU)/w畫強eFCE，除了用曳密奇.胤PD.*1$M7)弓印巴工用廿制M.WM,HAM.*中旭山,再二后鼻里

5、在珀炎埼曲”1、工3RM).人周蛾史口=質心.網圖值白用廣：由二七一br±*菱電收入*4寓青，*地車交«.方聯啟工匚代卜二厘他.圖“整iNiiKii：無M抱手*tie里二總種綻8伍增用.兇紀由±均*Hn+ilti-Ui.二#*$：=叼NMWL防虐位=.豉=電京也.帕f晅士*二.恐口£二斗=/_坐上比節內餐.王=炎一生宜守格三抗注目在.吃=算修了三毛MEW屈二甫口！制.者帶烹:二*2巴/9C£?f*6S.Hi=FW不&書X*F審理IE用情事無2.靈噌*笆羊五.叁至尊應£會蚤軍九二五五歸五=拈=干二療CI0F酶#年室.=“喉ijI

6、WLFCRrtM7K>wtt.ties,血初(g工.on).Cis三m.y單*.即m.小工WtF=百注QS5L*1看祥飛=，瓊通E=券*京釬H；EAECWBC.QEC.EKC.ETECI需亳1»,宜吉醇奉王，滔訴汨阿TFFkSt?"二SFW近g年出可有廣耳h_王/：-：-二二<»飛了扁*.三:.L-七堂三色手走在Ear(3=n株常關.削ftJd&fm.HEC為tW»±±曬晚轉整.EPK的占工齒1±±呻電函-EH匚號護一性狀局堤=臨床上在選擇mNG眥行病原微生物確認時應注意如下事項。1 .mNGS

7、檢測申t#表：mNG險測實驗室應提供適合臨床使用的申請表。除患者基本信息外,申請單應包括標本類型、擬診、現病史、既往史、流行病學史、關注的病原體、抗菌藥物使用史等。另外，申請表中應列出不同測序項目及適用范圍供醫生選擇。.靶向基因測序：基于高通量測序技術的病原微生物檢測，除無偏倚的mNGS卜，還包括原核生物的16SrRNA基因、真菌（5SrRNA基因兩端的ITS1、ITS2及25-28SrRNA基因中的D1及D2區等）以及特定病原微生物靶基因等17,如懷疑沙眼衣原體可選momp主要外膜蛋白基因），懷疑結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis,MTB可選rpoB等靶向基因測

8、序”19,20,21，臨床醫生通過測序實驗室提供的項目清單選擇適宜的項目，切忌大撒網式排查。.DNA測序與RNAM序的選擇：mNG鼓術理論上可檢測以核酸為遺傳物質的所有病原微生物。若臨床上已排除病毒感染，可直接進行DNA測序。考慮到DNA測序受人源基因組影響較大，為避免因死亡微生物DNA殘留影響現癥感染判斷，可進行RNA測序22,雙。當懷疑病毒感染，尤其對呼吸道、腦脊液（cerebrospinalfluid,CSF）及血液標本，或臨床表現復雜，無特定懷疑方向時，需要同時對樣本中的DN解口RNA進行測序。mNGS術本身是一種核酸檢測技術，由于不同微生物類別本身結構差別，其核酸釋放效率差異明顯，尤

9、其是真菌、分枝桿菌等核酸提取需要特定的破壁處理，對于疑似真菌或分枝桿菌感染時也應特別提出，在檢測過程中增加必要的樣本處理過程。.mNG即術的局限性：受臨床mNG豉術本身、測序成本及數據庫等影響，常規mNG策略常無法獲得樣本中所有微生物的序列，臨床標本中低濃度致病微生物可能會漏檢，同時針對特定的耐藥或毒力基因的分析亦較難實現如果需要對耐藥基因或毒力基因進行分析，可以采用特定方法去除部分人源宿主核酸以提升微生物基因組比例，或者結合耐藥相關基因或毒力基因進行靶向捕獲富集后進行。申請者如有特殊要求應加以注明。（二）標本類型及采集規范理論上，凡存在于臨床標本中的病原微生物均可通過mNGS僉出，但該技術的

10、準確性依賴標本中微生物的核酸質量及含量，也依賴于不同類別微生物核酸的提取效率。.血液及高凝標本：持針器肘靜脈采集35ml實驗室提供專用采血管，即游離DNA羊本保存管，內含乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA抗凝劑和保護劑，可抑制血漿中核酸酶及有核細胞中DNA勺釋放。采血時皮膚需徹底消毒，采血至刻度，上下顛倒混勻510次，條碼標記或編號。切忌在輸液處或導管處采集血標本。此外，高凝狀態的關節液、胸腹腔積液，甚至CSF也可采用此方法。如果增加RNA測序應同時采2管。.支氣管肺泡灌洗液及痰液：嚴格按操作規程采集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveol

11、arlavagefluid,BALF）,棄去前段可能污染的部分，回收10ml置無菌螺帽管（塑料或玻璃質地均可）中，內含支氣管末梢和肺泡中的分泌物。咳痰標本需在醫護人員協助下，患者用生理鹽水漱口23次，彎腰90°,用力咳出深部痰35ml置無菌螺帽管中。若無法自行咳痰，可通過吸痰器從氣道采集。咽拭子只適用于呼吸道病毒檢測。檢查容器有無滲漏，緊蓋后封口膜密封，條碼標記或編號。1 .CSF、房水及其他體液：經專科醫生標準化采集方法獲得，無菌螺帽管封口膜密封。CSF（留取第2管或第2管后標本）、關節腔積液、膽汁等檢測病原微生物DN頌RNA!采集1ml,如同時進行DNAMRNAIU序應采集2ml

12、。房水至少采集200科l。骨髓單獨進行DNARNA測序，0.5ml標本即可，如果同時進行DNAMRNA測序則至少采集1ml。這些臨床標本采集困難，切記防污染，避免經引流管采集。胸腹腔積液需富集后提核酸，至少采集10ml2L.膿腫及深部組織：（1）開放性膿腫需清創后采集深部傷口或潰瘍基底部分泌物拭子置無菌管中。（2）封閉的膿腫需對病灶局部的皮膚或黏膜表面徹底消毒，注射器抽取膿液，若少于3ml,應采集最大標本量送檢。（3）深部組織感染需手術取材，置于無菌螺帽瓶中。多數情況下組織中病原微生物含量低于膿液，盡可能取膿腫邊緣組織。2 .糞便標本：至少黃豆粒大小的新鮮標本，稀便35ml,置螺帽容器中。3

13、.標本轉運：若標本在24h內到達實驗室并開始檢測，可考慮冰袋低溫運輸；若運輸時間在2472h內，應干冰運輸，并立刻進行標本前處理和核酸提取；血液標本4C冰箱保存不得超過7d（專用采血管），在運輸過程中避免劇烈晃動；其他臨床標本如需長期保存，應按如下原則執行：（1）DNA測序：-20C保存不超過7do（2）RNA測序：應置-80C。（3）避免標本反復凍融，一般不得超過3次。（4）理論上-80C可長期保存。（5）若懷疑高致病性或新發突發傳染病，嚴格按照國內傳染病法等相關法律要求包裝及轉運。盡可能在醫院生物安全防護條件下抽提核酸后再送測序。建議1原則上，臨床懷疑病原微生物感染，常規方法未得到明確病原

14、學證據而影響臨床救治時，可利用mNG眥一步確認。鼓勵臨床在排除常見病原微生物后有目的選擇mNGS申請單應填寫臨床表現、癥狀體征、治療經過、現病史、流行病學史及既往史等。測序實驗室應讓申請者知曉不同類型感染性疾病的標本選擇、采集時機、采集方式、送檢量、轉運及儲存條件、不同mNG崎測策略的適用范圍。疑為傳染病應符合國家相關生物安全標本采集及轉運要求。申請者可提出重點關注的病原體，如呼吸道病毒、結核分枝桿菌、真菌及寄生蟲等。實驗室應提供適宜臨床使用的申請單，內容應包括不同mNG瓢U序策略及對應的適應證。（三）報告解讀原則目前病原微生物的確認依然遵循Koch法則，即：（1）該微生物存在于同類疾病患者中

15、，健康個體則無此微生物。（2）該微生物必須能夠被分離、培養、純化。（3）該微生物接種于易感動物可引起相同疾病，并可從被接種的動物體內分離到此微生物。（4）該微生物可引起每一個個體發病,25二但是，作為一種臨床檢驗方法，利用mNGSt認的感染病例并不能夠完全滿足傳統Koch法則，作為該法則的補充，mNGSI有如下特征。.mNG骷果分析：理論上，凡存在于標本中的微生物均可檢出，但因不同類型微生物基因組長度和測序平臺等差異，導致無法針對所有微生物建立統一的陰陽性判讀標準7'26,27,28:實驗室應根據預期用途、標本類型、檢測目標和技術特點，建立并驗證陽性閾值及判讀標準。原則上mNGS勺臨床

16、意義同核酸檢測。另外，決定一個序列是否來自于某種微生物，很大程度上取決于用于比較的參考微生物序列數據庫，如果數據庫中未包括該物種以及與其進化距離較近物種的基因組序列可能造成結果不準確。.mNG骷果確認：如果檢出的微生物符合疾病特征則可能是引起感染的病原微生物，但不能只從序列數多少確認，需考慮序列在基因組上的覆蓋度、特異性及保守性"”。該病原微生物可通過PCR等方法得到驗證，如呼吸道標本中的流感病毒、腺病毒及新冠病毒等；糞便標本中的志賀菌、沙門菌及諾如病毒等；CSF中的腸病毒、單純皰疹病毒及西尼羅河病毒等；血液中的布魯菌、巴爾通體及人類免疫缺陷病毒等。如果檢出高序列數的某種未命名微生物

17、，應高度警惕新物種的出現。.mNGS陽性閾值及判讀標準：報告單中的陽性閾值以百萬分子序列數確定。陽性閾值的確定不依賴某個單一的指標，包括但不限于特定微生物的檢出序列數、歸一化每百萬序列（readspermillion,RPM）的比值、檢出物種的基因組覆蓋度等。病毒因極少存活于環境中，因此，少量的特異序列檢出即可判為陽性（如少于3條特異序列）26O避免報出與臨床不相關的環境菌、共生菌及條件致病菌等。一般序列數越高病原微生物的可能性越大（數十條特異性序列）。對于結核分枝桿菌、鼠疫耶爾森菌、布魯菌等臨床關注度高、且較難檢測的病原菌可采用獨立的判讀標準，即檢出1條特異序列即可判為陽性”。寄生蟲基因組因

18、較為復雜，且與人源基因組相似，應在嚴格確認序列特異性之后再行判讀14o如果檢出序列為新發物種，則可不受閾值限制，但需給出同源性比對結果。.微生物種群致病：無菌部位膿腫標本可見多種病原微生物共檢出現象。如腦膿腫、頸間隙膿腫、咽旁膿腫、口腔膿腫等，所檢出的微生物序列數均可能達到陽性閾值，多數為嚴格厭氧菌與兼性厭氧菌共生。這種因微生物種群而致病的現象稱為一個種群或一個微生物生態系統引起一種疾病，而非Koch法則的一種病原菌引起一種疾病。盡管種群致病的理論還需進行深入探討，但隨著深度測序技術的廣泛應用，這種現象在臨床上將得到更多驗證29o.不可培養或難培養微生物的結果驗證：mNGSt對標本中所有病原微

19、生物核酸序列，不可培養或難培養微生物不能通過傳統培養方法再現，且這類病原微生物同樣缺乏血清學或抗原檢測。除病毒、螺旋體、立克次體、寄生蟲外，這些微生物可通過核酸檢測驗證，測序同樣是診斷的金標準。.致病菌、定植菌和污染菌：當確定條件致病菌為病原菌時應考慮患者免疫狀態、基礎疾病及標本來源。若出現大量背景菌或雜菌序列而無主導微生物應首先考慮污染，其次考慮條件致病菌。如果外科手術或其他有創操作后，無菌部位來源的標本，表現為細菌單一，序列數可能不高，應結合臨床考慮醫院感染，此時應與背景菌區分，不可一味認為污染。mNG加能區分微生物是定植還是感染。mNGS僉測陰性對排除感染有意義，但也應結合臨床表現作出正

20、確的診斷14'28。.高度傳染性微生物：針對具有高度傳染性的特殊病原微生物，實驗室應根據相關衛生行政部門的規定制定特殊報告程序，標本上傳疾病預防控制中心（CenterforDiseaseControlandPrevention,CDC,如當出現像疑似O1群或O139群霍亂弧菌、鼠疫耶爾森菌、埃博拉病毒或新型病原微生物等，應盡快采用其他方法驗證，如PCR血清學等，如果支持測序結果應迅速反饋臨床和CDC系統。.提高測序深度：mNGST規數據量對耐藥和毒力基因檢測有局限性8'30,因其得到的微生物序列數不足樣本總序列的5%特異性序列覆蓋度不到微生物基因組1%在這種情況下進行耐藥基因、

21、毒力島基因、轉錄組及代謝通路分析幾乎不可能。目前，有以下幾種做法可提高測序深度：（1）在常規測序深度下已明確了病原微生物，再提高測序數據量至可覆蓋該物種基因組80%但花費巨大不適合普及。（2）在宏基因組基礎上疊加固定的若干種耐藥基因進行靶向測序。（3）研發降低人源核酸比例的創新方法，獲得更多微生物測序數據量""31o建議2mNGS乍為一種新型檢測方法，其臨床意義仍未超出核酸檢測范疇，它補充了傳統病原微生物確認的Koch法則。mNGST檢測難培養、罕見或新發病原微生物，可同時給出多種病原微生物信息，因此，在一份無菌部位來源的臨床標本（尤其膿腫）中檢出微生物種群（包括不同類別或

22、同類不同種屬）不應輕易視為污染。如果這些微生物的存在符合臨床診斷，應給予抗菌藥物全覆蓋，這恰好體現了該技術對全面認識病原微生物的優越性。mNGST規數據量對耐藥和毒力基因檢測有局限性，如需耐藥和致病信息需提高測序數據量。建議3如果檢出的病原微生物符合臨床預期，應確認序列結果的準確性和特異性。為提高結果的特異性，降低錯誤率，即使病原微生物也應建立陽性閾值。陽性閾值建立在微生物特異序列數及其在基因組覆蓋度上。臨床醫生在解讀條件致病菌時，應排除污染和背景微生物，考慮患者免疫狀態及與臨床表現的符合性。mNGS吉果不能作為臨床決策的唯一依據，結果陰性也需結合臨床排除感染。二、mNGS檢測病原微生物的實驗

23、室要求mNGS是NGS技術的一種，多數實驗室采用邊合成邊測序方法32二該方法使單個DNA分子擴增成大量相同的DNA,然后同步復制，以此增強熒光信號強度，從而讀出DNA序列。因此，mNGS具有通量高、讀長短、流程復雜、操作環節多、對實驗環境及人員要求高的特點。因此，對實驗室設施要求高，需要嚴格遵守臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法的相關規定。（一）實驗室分區及人員要求.基本原則：即各區獨立、注意風向、因地制宜、方便工作，以達到工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時16。mNGS僉測分“干、濕實驗”，“濕實驗”指從樣本處理到測序數據產生的整個測序過程，需要在標準的測序分區實驗室完成。一般“測試分區

24、實驗室”分試劑準備區、標本處理與核酸提取區、文庫構建區及測序區。“干實驗”指測序數據的生物信息學分析。.單向工作流程：若實驗室設有緩沖間，緩沖間統一為正壓或負壓。若未設緩沖間，從試劑準備區到測序區壓力依次遞減。為避免相互干擾，DNARNAB作（核酸提取）應分開。如在同一實驗室應分兩個區域，主要儀器耗材包括生物安全柜、核酸提取儀、移液槍、離心機、試劑及耗材等不可混用。如使用瓊脂糖凝膠電泳檢查核酸及文庫質量，則需有單獨的電泳區。靶向測序PCRS在單獨的擴增區進行3”。.污染防控：應定期進行環境評估，為了監控污染需制定試劑、儀器和實驗室物表定期消毒的標準作業程序（standardoperationp

25、rocedure,SOP。還應對無模板參考品或陽性對照中可能出現的污染物進行連續跟蹤，并使用保守的閾值標準（見第一章第三部分報告解讀原則3）,最大程度減少假陽性結果產生9o.實驗室人員能力：實驗室人員應參加相關培訓，并獲得國家要求的相應資質27'34。檢驗人員應具備mNG頷目制定和質量控制能力。報告簽發人員應具備臨床醫學、微生物學和分子生物學背景，掌握相關臨床診療指南。疑難報告的簽發及結果解釋需咨詢相關領域專家。開展mNG氧驗室自建檢測項目(laboratory-developedtests,LDT)的實驗室同時還應具備生物信息學分析的專業人員，生物信息學分析人員需熟練掌握mNG驗測原

26、理及生物信息軟件，具備數據信息維護和管理、開發新算法及更新數據庫的能力。建議4微生物檢測非靶向mNG氧驗室至少應包括試劑準備區、樣本制備區、文庫制備區及測序區。實驗室工作流程應為單向。若實驗室設有緩沖間，緩沖間統一為正壓或負壓。若未設緩沖間，壓力從試劑準備區到測序區依次遞減。DN用口RNAK酸提取分區域進行。若開展靶向擴增NGS1序，應額外增加擴增區及電泳區。若同時開展遺傳及腫瘤NGS核酸提取及建庫過程不宜與之混用。報告簽發人員應具備臨床醫學、病原微生物或分子生物學背景，罕見病原微生物結果解釋可咨詢相關領域專家。若配備有生物信息學分析人員，需掌握mNGS微生物檢測軟件應用，具備數據信息維護和管

27、理、開發新算法及更新數據庫的能力。1 (二)檢測平臺.建立標本前處理及核酸提取方法：標本預處理方法和核酸提取技術在使用前需經過驗證。.測序平臺的選擇：包括儀器設備的選擇、測序平臺質量的評價及主流測序平臺類型3個方面。配備開展高通量測序檢測項目所需的所有儀器設備：優先選擇國家藥品監督管理局(NationalMedicalProductsAdministration,NMPA批準的測序平臺和配套試劑。測序平臺應達到臨床預期：除開展滿足臨床需求的項目外，測序通量、序列的準確率、支持讀長、儀器性能驗證、內部質控、測序周期及批量檢測能力等也是評價測序平臺質量的重要指標。主流測序平臺：目前，mNGS主流測

28、序方法有邊合成邊測序、DNA納米球測序及半導體測序。實驗室根據需要選擇適宜的檢測平臺，使用模擬樣本或臨床已知微生物樣本驗證測序全流程。表2列出了不同類型測序平臺的技術特點及環境要求。.自動化測序平臺：mNGSi：生物檢測的靈敏度與標本背景有關，如組織標本中含有大量人源基因組，導致微生物序列數占比減少，通過高效自動化測序平臺，增加測序深度可提高檢測靈敏度。自動化過程降低人工操作、減低外源污染，實驗室分區簡化。已有文獻報道實現了血液、CSR尿液等標本，從文庫構建到報告發放全自動化過程,雙。自動化平臺應包括標本前處理、核酸提取、文庫構建、高通量測序、生物信息分析和報告發送。（三）生物信息平臺生物信息

29、學分析（也稱“干實驗”）是mNGS僉測中的重要部分，是對測序產生的原始數據進行處理和分析，包括但不限于數據質控、人源序列比對過濾、微生物物種檢測等過程35,36,37目前尚無統一的標準化數據分析程序及軟件。數據分析流程由多種分析軟件配套完成，包括數據質控軟件（如Fastp、Trimmomatic、FastQC等）、比對軟件（如Bowtie2、BWAMAQSOAP2Blast等）、物種分析軟件（如SURPITaxonomer、MegaBLAST?）38,39二人源基因組和微生物基因組檢測數據庫有美國國家生物技術信息中心、美國病原體系統資源整合中心,4“、真核生物病原體數據庫41及病毒病原數據分析

30、資源庫42,等，在構建物種比對數據庫時可予以選擇，還有耐藥基因分析可考慮抗性基因數據庫43,44,3，毒力基因分析可使用毒力基因分析數據庫46,47等。隨著mNG彳品的體外診斷化發展，結合人工智能技術的自動化的數據分析系統已經能夠提供給臨床實驗室。建議5實驗室構建mNG皴術平臺以擬開展的檢測項目及科研工作為依據，充分論證不同檢測平臺的適用性，包括生物信息平臺。技術平臺的建設應包含標本處理、核酸提取、文庫構建（DN解口RNA文庫）、高通量測序、核酸擴增、產物分析、數據分析等全流程。采用模擬樣本或臨床已知病原體樣本對所有技術環節進行驗證，包括檢測靈敏性、測序通量、序列質量、讀取準確率、支持讀長、儀

31、器性能驗證、內部質控、測序周期及生物學信息分析能力。比對數據庫應滿足各類微生物檢測需求。三、mNGS微生物檢測方法的建立（一）標本前處理標本液化、濃縮及去除宿主核酸等前處理方法和設備使用應標準化。所有標本應具有唯一標識，防止在信息錄入和標本分揀過程中交叉污染。根據申請要求提前準備被檢測微生物所需的文庫資料及生物信息分析軟件。建立臨床標本的前處理程序，包括復雜標本、微量標本和組織標本的前處理程序，針對真菌和/或分枝桿菌等特殊微生物的破壁處理程序。建立RNA病毒、微生物游離核酸測序的前處理方法。建立組織標本研磨方法，具體方法見表3。（二）核酸提取.使用經性能確認的核酸提取試劑：臨床標本中存在不同類

32、型的病原微生物，核酸提取方法的可重復性和提取效率對保證核酸的完整性及純度至關重要。實驗室應根據臨床標本類型和微生物種類建立針對性的標準化提取程序。建議使用經性能驗證的商品化提取試劑及設備。1 .核酸質量驗證：（1）高質量的DNAA60/A80應在1.71.9,A260/A230應2,可用1面脂糖凝膠電泳驗證DNA質量（無雜帶、無拖尾、背景無蛋白污染）。（2）DNA完整性（如Agilent2100Bioanalyzer）檢測，如果大部分片段在200nt（血漿游離DN喉外，140nt）以下說明DNA降解嚴重，需重提。（3）高質量的RNAAWA280應在1.82.0,A260/A230應2。（4）微

33、量的核酸采用Qubit熒光染料法進行定量測定15o.核酸含量極低樣本的處理：如CSF房水等，應在標本中加50。ATL（DR研磨珠，低頻震蕩10min,離心后取150口。加入150口裂解?和8口蛋白酶K,渦旋震蕩混勻30s,56C恒溫震蕩15min（若無恒溫震蕩儀，可用金屬浴代替，期間每3min混勻1次）；取裂解后的樣本300小，加入磁珠240小，震蕩混勻，室溫靜置5min,上清提核酸。按照商品化的操作說明進行。.去除人源DNA的方法：多數臨床標本存在大量宿主細胞和宿主游離核酸，微生物核酸豐度相對較低。因此，在核酸提取環節中可考慮建立高效去宿主DNA法，提高mNG激生物檢測的靈敏度4l48去除人

34、源核酸的方法選擇需要結合臨床檢測目的，舉例如下。去污劑處理：因人源細胞的細胞膜較微生物外壁脆弱，在核酸提取前用溫和去污劑（如皂甘）裂解宿主細胞釋放DNA再用脫氧核糖核酸酶I降解人源DNA通常可使微生物富集效率提高1000倍49。DNA8,低滲溶液破壞宿主細胞：使用細胞膜不透性的疊氮碘化丙錠結合暴露在溶液中的宿主DNA使抗甲基化DNAf珠：因人源DNA甲基化程度高，大多數微生物基因組中缺乏甲基化用抗甲基化DNA磁珠可有效去除人源DNA可實現35倍富集雙。2 使用CRISPR-Cas9（基因編輯技術）剝離目標序列：此法對構建RNA文庫較為有利，可提高非編碼rRNA序列含量，但對DN成庫構建意義不大

35、，不推薦花費更大財力去除全部人源DNA.qPCR預估人源核酸的去除效率：去除宿主DNA后，對宿主及微生物常用的標志基因，如3肌動蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因和16SrRNA基因等，進行實時熒光定量PCR（quantitativereal-timePCRqPCR定量檢測，通過經驗積累大概預估宿主殘余比例及有效數據比例，必要時可提高測序數據量。（三）文庫制備文庫制備是將基因組DNA片段化并在片段末端連接寡核甘酸接頭的過程，文庫質量直接影響測序數據質量。目前常用的建庫方法有超聲波打斷建庫、酶切建庫及轉座酶建庫等，選用操作簡單的方法對降低污染有利。.明確核酸質量及文庫產出標準：實驗室根據文庫制

36、備方法及測序平臺明確起始核酸質量標準（純度、濃度）及文庫產出標準（文庫濃度、片段大小等）。.建議使用配套試劑：若起始DNA10ng以上，可采用普通建庫試劑盒；若DNAa100pg10ng之間，則采用超微量DNA建庫試劑盒；若DNA量低于下限，應先行全基因組擴增，再進行建庫。.構建RN成庫：逆轉錄前需在冰上操作，防止RNA條解。應添加RNAB抑制劑，必要時在建庫前采用雜交捕獲法或核糖體分離法去除rRNA。.文庫質量：可采用Qubit熒光染料法檢測文庫濃度，qPCR檢測文庫中有效連接接頭的核酸濃度。上機前需根據不同的測序平臺對文庫濃度的要求進行。高質量的文庫DNA其A60/A280通常在1.752

37、.00。此外，還應采用生物分析設備檢測文庫片段大小及峰型，文庫片段大小為插入片段和接頭序列的總長度，合格文庫插入片段長度大于100bp,文庫應主峰明顯、無雜峰、無接頭、無引物二聚體15o建議6實驗室應具備針對不同類型臨床標本的前處理方法，尤其針對復雜和極微量標本應具備經驗證的靈敏的手段。無論DNA還是RNA核酸提取質量應滿足測序要求。在核酸提取的過程中應引入經驗證的降低人源核酸處理方法。推薦使用配套試劑構建文庫，根據初始核酸濃度選擇文庫建庫試劑盒，若DNA量低于下限應先行全基因組擴增再進行建庫，文庫核酸濃度、純度及長度應達到測序（包括靶向測序和宏基因組測序）要求。文庫制備方法需用已知臨床標本或

38、模擬樣品或質控品進行驗證或開展實驗室間比對，合格后方可用于臨床。（四）上機測序測序數據量指每個樣本測序所得的序列數或堿基數（nt）,二者可相互轉換，一般宏基因組測序用序列數表示。測序數據量與預期用途（如微生物檢測、耐藥基因檢測、微生物組學分析、宏基因組學分析等）、樣本中微生物與人源核酸占比、測序靈敏度以及測序成本等因素相關。mNGSi：生物檢測的靈敏度與標本人源核酸含量有關，不同類型臨床樣本人源核酸平均含量不一樣，為保證結果可靠性，在相同樣本處理和核酸提取方法時，通常不同類型臨床標本推薦不同測序數據量，原則上背景簡單的標本如CSR血漿等（人源核酸含量低）較低的測序數據量即可滿足病原微生物檢出。

39、在條件允許的情況下可增加測序數據量以提高檢測靈敏度。可通過數據抽樣，即從下機數據中（如20M）隨機抽取15M組成一個模擬的15M測序數據集模擬分析不同測序數據量、不同物種的檢測限，從而最終確定不同標本類型的最佳測序數據量。通常靶向測序的數據量應A3萬條序列，宏基因組測序鳥槍法測序數據量應R2000萬（20million,20M）高質量序列，準確度Q30比例R85%也有文獻推薦CSF600萬條（6M）序列26一、血液游離DNA2400萬條序列（24M）皿、咽拭子病毒檢測1000萬條（10M序列等。測序數據量提升可顯著提高靈敏度，以血流感染為例，每個標本平均20M序列時，總體靈敏度為31%,每個標

40、本平均24M序列時，總體靈敏度達到48%雙，當每個標本平均數據量達到33M序列時，總體靈敏度達到71%53。（五）生物信息學分析生物信息分析是對測序得到的原始序列進行數據分析和處理的過程，以預定程序執行。該流程由多個軟件組成，包括去除人源序列、處理微生物序列及相關元數據、檢測候選目標微生物，實現檢測與數據的轉換。數據分析中應考慮預期用途、軟硬件功能、數據存儲位置、版本號及信息備份等。同時應確保患者信息安全，設置讀取規則、人員權限、數據異常提取的警報。目前已經具有商業化的自動分析系統可以選擇，實驗室也可選擇與國際同步的算法和軟件，搭建實驗室自己的分析流程，搭建過程中應選已知陰陽性樣本或質控品進行

41、生物信息學分析能力模擬測試。.序列質量：堿基質量值是衡量測序質量的重要指標，用于評估下機序列數的準確度。質量值（Q越高代表堿基被測錯的概率（P）越低，兩者關系為Q=-10lgP。Q20對應的測序錯誤概率為1%準確率99%Q30對應的測序錯誤概率為1%o、準確率99.9%。常用Q20和Q30分別代表質量值R20或30的堿基所占百分比。實驗室應要求保證Q30至少達到85%在對測序數據進行分析之前，應首先進行質量控制，去除讀長過短（如<50bp）和低質量的序列，獲得的高質量序列再與人源基因組比對去除，剩余序列進入后續的微生物檢測分析11,14,151O.判讀標準：判讀標準與測序數據量密切相關，

42、在生物信息學分析流程搭建和優化過程中，應確定判讀標準，以區分陰陽性結果。實驗室應對不同類型的臨床標本和不同類型微生物建立不同的判讀標準。判讀標準應包括但不限于檢出序列數、基因組覆蓋度、微生物豐度、測序深度、離散度、RPM匕值等技術指標雙。高通量測序得到的是大量短序列（通常在100bp以內），因此，當序列比對到參考序列時，如同時出現人源和某種微生物，則優先判為宿主序列。判讀為某微生物屬水平的序列數應大于種水平。當種水平序列數越接近屬水平，則該物種的可能性越高。比對到微生物的序列數與基因組測序覆蓋度呈正相關。實驗室可根據基因組覆蓋度、序列特異性等參數計算出病原微生物檢測可信度（%,便于臨床判斷。其

43、他判讀方法：有文獻通過自建參考品先設定判讀標準，再采用臨床標本進行判讀標準的確認。也有文獻通過檢測一定數量的已知陰陽性樣本，采用統計學方法，如受試者工作特征曲線或準確率-召回率（precision-recall,PR）曲線來確定合理的判讀標準皿。.陽性閾值：判讀為陽性的界值即為陽性閾值。閾值的設置與檢出序列數、檢出序列的特異性、特異序列的基因覆蓋度、該物種同源性復雜程度以及檢測靈敏度有關。即使病原微生物也應制定陽性閾值。針對某些特殊傳染病病原微生物，在排除污染的前提下，即使檢出1條序列也應視為陽性，如MTB鼠疫耶爾森菌及流行性出血熱病毒等“29。.數據庫：包含兩個部分，即微生物檢測數據庫和人源

44、數據庫。微生物檢測數據庫包含細菌、真菌、病毒和寄生蟲基因組序列信息，其中支原體、衣原體、螺旋體、立克次體視情況可獨立也可并入細菌類別中。公共數據庫需經驗證方可使用。構建微生物數據庫應優先選擇全長參考基因組以及測序質量高、樣本來源、臨床信息完整的序列。臨床重要的病原微生物應入選具有時間和地域代表性的毒菌株基因組。有條件應構建科研數據庫二級數據，以確保重要的病原微生物不錯報、不漏報。人源數據庫是為去除人源序列干擾而設計，包含染色體基因組、線粒體基因組及轉錄組等序列信息。收錄的信息應確保準確、完整、有詳細注釋，不是越多越好。推薦采用模擬數據對數據庫的有效性進行驗證（見本文第四章第三節分析性能確認）5

45、6。1 .具備數據庫更新能力：實驗室應持續跟蹤使用版本的數據庫。應使用標準化數據集對更新后的數據庫進行驗證，確保數據的準確性和可重復性。6,建立背景微生物數據庫：mNGST能含有多種微生物信息，其中不乏正常菌群、污染微生物及背景微生物。應建立人體不同部位正常種群數據庫，并納入報告分析解讀流程。雖然有些微生物存在于標本中，但與疾病無關，應在報告中去除或說明。此外，mNGSf程中所用的各種試劑中也可能存在微生物個體或核酸，應建立試劑背景微生物序列數據庫，在報告中予以去除。7.建立錯誤數據彳正機制：mNG麗樣存在測序錯誤的情況，因此需去除原始下機數據中的低質量序列，包括測序接頭污染的序列、質量值低的

46、序列及短重復序列等。由于mNG的批量標本平行上機測序，難以完全避免標簽跳躍，應通過技術手段與分析流程防止高拷貝微生物序列污染平行上機樣本。建議7實驗室需通過已知標本確立不同類型標本個性化的測序數據量、驗證序列質量值、確定判讀標準及不同類型微生物陽性閾值。在進行序列比對時掌握如下原則：序列比對一致性相同優先考慮人源序列，該序列與數據庫中微生物種屬匹配度高、屬水平序列數大于種水平、種序列數越接近屬水平則確認該種的可能性越大、結果的可靠性與基因組覆蓋度成正比、低于陽性閾值的病原微生物不可輕易放過，需結合臨床或復檢或重留標本再測。建議8實驗室應使用國際公認或經驗證或文獻推薦的公共數據庫，包括人源數據庫

47、與微生物數據庫。實驗室可在臨床用庫的基礎上建立二級科研數據庫，以便應對罕見或新發微生物。建立生物信息學分析程序并進行性能確認，確定測序數據量與不同類型微生物的判讀標準。生物信息學分析程序滿足預期檢測性能參數，結果應符合預期要求。實驗室應建立監測生物信息學分析程序，記錄分析流程中各組分改變或版本更新（如軟件升級、數據庫更新、腳本更改等），定義流程及數據庫的版本號，以保證報告的可溯源性。（六）檢驗報告.基本要求：過濾后的序列才可用于微生物檢測報告，用于種屬檢測的短序列應為特異序列，特異序列作為最后報告的陽性閾值。正式報告單應包括測序總序列數、內標檢測數據量、檢測病原微生物列表、檢出病原特異序列數量

48、、檢測病原范圍、測序數據質量、檢測方法及檢測技術說明。同時對相關專業術語進行解釋說明，并注明檢測方法的局限性、檢測的靈敏度和特異性以及疑似背景微生物等。由于測序可檢出以往罕見的病原菌，需解釋物種來源、致病性、流行病學特點及最新研究結論等58二科研mNG版告應滿足用戶要求。實驗室應保留所有檢出的微生物參數，包括但不限于比對序列數、相對豐度、基因組覆蓋度和測序深度等。.報告單的使用：從技術角度講，mNGS0性或陰性結果不能作為臨床診療決策的唯一依據，即使無菌部位標本的mNGS吉果也需結合臨床表現或其他本查結果進行綜合判斷。mNG酸出或未檢出某物種的核酸片段，提示患者標本中含有或不含有該物種核酸，但

49、不能明確該物種與感染的關系，即mNGS日性不一定是病原微生物。另一方面，受取樣及病程變化、測序策略本身的靈敏度局限、實驗室檢測能力和生物信息學分析水平的影響，mNGS僉測陰性結果也需結合臨床進行判定。從法律角度講，無認證實驗室的檢測結果不能成為診斷依據，僅做研究所用。因此，目前國內任何實驗室出具的mNGSt生物檢測報告均不可直接用于臨床診斷，也不應成為醫療文書59:建議9用于臨床輔助診斷的mNGS艮告應包括測序總序列數、檢測病原微生物列表、檢出病原特異序列數量、檢測病原范圍、覆蓋度、測序深度、檢測方法及檢測技術說明。mNGS吉果的本質與PCR相似，代表臨床標本中檢出或未檢出某微生物的核酸片段，

50、不能明確該物種與感染的關系，即使陰性結果也需結合臨床表現及其他檢查結果進行綜合判斷。四、性能確認優先選擇NMPA批準的儀器與試劑，如果改變獲批試劑制定的預期用途、試劑組分、操作流程等，則按照LDT試劑要求進行管理，在開展臨床服務之前所有與mNGS有關的儀器、試劑、檢測流程、數據庫及分析軟件均需進行性能確認。（一）測序平臺的性能確認依據檢測項目及臨床預期用途，綜合考慮測序讀長和通量、測序準確率、運行時間、測序成本等選擇測序平臺。安裝時，由廠方工程師按照說明書所注明的儀器性能指標逐項驗證，達到廠方聲稱的指標并滿足臨床預期用途為合格。（二）生物信息分析平臺的性能確認實驗室可以選擇商業化的自動分析系統

51、，也可需根據檢測項目和預期用途選擇合適的算法和軟件，搭建本實驗室的生物信息學分析流程，并進行必要的性能確認，以保證對病原微生物檢測的準確性。性能確認包括但不限于最低測序數據量及堿基識別質量值等，實驗室應根據國際上本領域發展不斷優化分析平臺。臨床標本的測序數據是進行性能確認時最重要的數據，即臨床標本mNG除流程檢測后得到的測序數據。計算機模擬的測序數據可通過數據模擬軟件ART等軟件生成59,60,但是計算機模擬和參考物質的測序數據只能作為補充數據，不能完全替代臨床標本測序數據。（三）分析性能確認分析性能確認包括從臨床樣本前處理到生物信息學分析的全過程，觀察指標至少應包含精密度、準確度、可報告范圍

52、、分析敏感性、分析特異性等。1 .精密度：指在規定條件下所獲得的多次獨立檢測結果的一致度，評價檢測方法的重復性。包括對同一批樣本在同一條件下（相同的環境、操作人員及儀器）至少進行3次以上檢測,評價重復精密度，以及不同日間、不同人員、不同儀器（相同型號）至少進行3次以上檢測，評價再現性精密度。可選擇高、低2個不同梯度的參考品進行驗證，精密度應>90%T。2 .準確度：是指與真陽樣本、真陰樣本結果或金標準方法檢測結果的符合率。對準確度的評價可通過兩部分進行。通過臨床樣本驗證：選另一NMPAB獲批或被普遍接受白金標準方法與mNGS時檢測臨床樣本，比較mNGST金標準方法之間的差異，不一致的結果

53、再用第3種方法進一步確認，通過陽性符合率和陰性符合率評價定性測定的準確度16135161,62。通過參考品驗證：mNGSB前尚無國際或國家參考品，實驗室可自制企業參考品進行驗證。細菌、真菌、寄如在明確陰性或健康人標本中摻入不同類型病原體的標準參考品（如病毒、生蟲等）制備模擬陽性樣本，建議使用810種病原微生物（包括RNA病毒）驗證檢測的準確度。樣本數量不少于20例，濃度范圍應覆蓋高、中、低，一致率應大于90%26'62二.最低檢測限（limitofdetection,LoD）:用于描述測序方法的分析敏感性，它是指能夠通過測序獲得準確目標微生物的最低濃度，一般要求可信度R95%可根據預期

54、用途、標本類型等，選擇含有代表物種的混合參考品，10倍梯度稀釋進行檢測，每個梯度至少3個重復，計算出LoD值，并在該LoD濃度進行20次以上重復，確保95%勺檢出。實驗室需要建立不同樣本類型、不同代表物種的LoD63。.分析特異性：分析特異性主要評價樣本中潛在干擾物質對檢測結果的影響。mNGSt大的干擾物是人源核酸，高濃度的宿主背景可嚴重降低檢測靈敏度。痰標本需增加黏蛋白對結果干擾程度的評估。血液標本需增加血紅蛋白干擾程度評估。應使用接近臨床真值的干擾物濃度進行驗證，建議包含每種干擾物質的潛在最大濃度。可將不同含量的干擾物質分別添加到陽性樣本中，以評估干擾物質對檢測結果的干擾程度。mNG陰析特

55、異性還需考慮近源物種的交叉反應，即鑒別不同亞種、亞型的能力4雙。.可報告范圍：mNGS的可報告范圍理論上應為參考數據庫中包含的所有微生物，在對參考數據庫進行更新升級時，可報告范圍也相應發生變化。實驗室應在數據庫升級時對可報告范圍和上述各項性能指標重新進行確認。在準確度驗證中，應確認可報告范圍，實驗室在日常檢測中，應對可報告范圍持續關注和確認26二（四）性能確認的樣本要求.代表性：涵蓋不同類型微生物的各類感染標本是理想的性能驗證樣本。未經性能驗證的標本類型應被視為無法準確得到結果的樣本。如果缺少具有代表性的病原微生物，可使用模擬樣本代替。不同類型微生物應特別強調結核分枝桿菌、絲狀真菌、RNA病毒

56、及寄生蟲。不同類型的臨床標本特別強調血液、CSFBALE組織標本和關節液及胸腔積液。.樣本量：進行分析性能驗證的樣本量需達到統計學意義。有文獻建議精密度確認至少需3份樣本，準確度評價至少檢測59份樣本，進彳TLoD評價時至少需要檢測20次。如果短時間內無法獲得豐富的樣本類型及微生物種類，可選PCR已知微生物的人源DNA含量低（CSF及血漿）及高含人源DNA羊本（痰及BALF）各2份進行驗證，如果可準確檢出，則認為系統滿足mNGSt用。其他類型樣本可在實踐中逐步補充完善®64o（五）臨床性能確認臨床性能確認包括臨床敏感性和特異性。實驗室需結合臨床信息對檢測結果進行臨床性能確認，如常規檢

57、查、影像學檢查、臨床表現及臨床醫生的判斷等。如果疾病種類、標本類型及病原微生物的覆蓋度無法達到臨床性能確認的統計學標準，實驗室可從無癥狀對照組獲得臨床特異性的指標。此外，也可根據文獻建立臨床性能確認指標7'26'35o建議10使用NMPA比準的mNG斌劑應進行分析性能驗證，LDT試劑應根據預期用途進行方法設計和優化，并對檢測全流程進行整體的性能確認。分析性能確認應包含不同類型樣本及重要病原微生物，如果沒有足夠的臨床樣本可用模擬樣本代替。分析性能確認包括但不限于精密度、準確度、檢測限、分析特異性和可報告范圍等。在確認分析性能后建立“濕實驗”和“干實驗”的SOP明確性能參數及檢測局限性。若實驗室流程改變需進行全面或部分性能再確認。五、質量保證（一）質量要素質量要素包括核酸提取的濃度和純度、文庫構建所需的核酸量、文庫片段分布、文庫濃度、最低測序數據量、符合要求質量值的堿基百分比（如Q30）以及檢測的局限性、檢測全過程SOP（采樣要求、樣本前處理、核酸提取、文庫制備、上機測序、生物信息學分析等）及其他參數（內標、質控品、分析參數、質量標準、數據庫等）。若試