1、 通則0512高效液相色譜法 （ 2016年3月26日 ） (藥典四部60頁) 13 / 13高效液相色譜法：系采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。 注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內，各組分在柱內被分離，并進入檢測器檢測， 由積分儀或數 據處理系統記錄和處理色譜信號。1.對儀器的一般要求和色譜條件高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數據處理系統組成。色譜柱內徑一般為3.94.6mm，填充劑粒徑為310m。超高液相色譜儀：是適應小粒徑（約2m）填充劑的耐超高壓、小進樣量、低死體積、 高靈敏度檢測的高效液相色譜儀。（1）&#

2、160;色譜柱反相色譜柱：以鍵和非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復合硅膠和聚合物等；常用的填充劑優十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基鍵合硅膠等。正相色譜柱： 用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠 和 氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反向色譜。離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。色譜柱的內徑和長度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、載體表面基團殘留量，填充的致

3、密與均勻程度等均影響色譜柱的性能，應根據被分離物質的性質來選擇合適的色譜柱。溫度會影響分離效果，品種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫，應注意室溫變化的影響。為改善分離效果可適當提高色譜柱的溫度，但一般不宜超過60。殘余硅羥基未封閉的硅膠色譜柱，流動相的pH值一般應在28之間。殘余硅羥基已封閉的硅膠、聚合物復合硅膠或聚合物色譜柱可耐受更廣泛pH值的流動相，適合于pH值小于2或大于8的流動相。（2） 檢測器 最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測

4、器、電化學檢測器為選擇性檢測器， 其響應值不僅與被測物質的量有關，還與其結構有關；蒸發光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器， 對所有物質均有響應，結構相似的物質在蒸發光散射檢測器的響應值幾乎僅與被測物質的量有關。紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和示差折光檢測器的響應值與被測物質的量在一 定范圍內呈線性關系，但蒸發光散射檢測器的響應值與被測物質的量通常呈指數關系，一般需經對數轉換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。紫外-可見分光檢測器所用流動相應符合紫外可見分光光度法（通則0401）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發

5、光散射檢測器和質譜檢測器不得使用含不揮發性鹽的流動相。（3）流動相 反相色譜系統的流動相常用甲醇水系統和乙腈水系統，用紫外末端波長檢測時，宜選用乙腈-水系統，流動相中應盡可能不用緩沖鹽，如需用時，應盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流動相中有機溶劑一般不低于5%，否則導致柱效下降、色譜系統不穩定。正相色譜系統的流動相： 常用兩種或兩種以上的有機溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。品種正文項下規定的條件除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等，均可適當改變，以達到系統適應性試驗的要求

6、。調整流動相組分比例時，當小比例組分的百分比例X小于等于33%時，允許改變范圍為0.7X1.3X； 當X大于33%時，允許改變范圍為X-10%X+10%。若需使用小粒徑（約2m）填充劑，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也應作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時，應以品種項下規定的色譜條件的測定結果為準。當必須使用特定牌號的色譜柱方能滿足分離要求時，可在該品種正文項下注明。2.系統適用性試驗色譜系統的適用性試驗： 通常包括理論板數、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復性等五個參數。色譜系統的適用性試驗定義： 按各品種正文項下要求對色譜系統進行適用性試驗

7、 即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗， 必要時，可對色譜系統進行適當調整，以符合要求。（1）色譜柱的理論板數（n） 用于評價色譜柱的分離效能。 由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數作為衡量柱效能的指標時， 應指明測定物質，一般為待測物質或內標物質的理論板數。在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分色譜峰或內標物質色譜峰的保留時間tR 和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2）， 按下式計算色譜柱的理論板數： n = 16（ tR / W）2 或 n = 5.54（ tR / Wh/2 ）2 tR、W、

8、W h/2 可用時間或長度計（下同），但應取相同單位。（2） 分離度（R） 用于評價待測物質與被分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統分離效能的關鍵指標。 可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度， 對色譜系統分離效能進行評價與與調整。 也可以通過測定待測物質與某一降解產物的分離度，無論是定性鑒別還是定量測定，均要求待測物質色譜峰與內標物質色譜峰或特定的雜質對照色譜峰及其他色譜峰之間有較好的分離度。除另有規定外，待測物質色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應大于1.5。分離度的計算公式為： 式中 tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時間 tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時間 W1、W2及W1

9、,h/2、W2,h/2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬（如圖）。 當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結果為準。（3）靈敏度 用于評價色譜系統檢測微量物質的能力，通常以信噪比（S/N）來表示。通過測定一系列不同濃度的供試品或對照品溶液來測定信噪比。 定量測定時，信噪比應不小于10； 定性測定時，信噪比應不小于3。 系統適用性試驗中可以設置靈敏度實驗溶液來評價色譜系統的檢測能力。（4）拖尾因子（T） 用于評價色譜峰的對稱性。 拖尾因子計算公式為： 式中 W0.05h為5%峰高處的峰寬；d1為峰頂在5%峰高處橫坐標平行線的投影點至峰前沿與此平行線交點的

10、距離（如圖）。 以峰高作定量參數時，除另有規定外，T值應在0.951.05之間。以峰面積作定量參數時，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分， 但嚴重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準確性， 此時應在各品種正文項下對拖尾因子作出規定。（5） 重復性 用于評價色譜系統連續進樣時響應值的重復性能。 采用外標法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續進樣5次， 除另有規定外，其峰面積測量值的相對標準偏差應不大于2.0%； 采用內標法時， 通常配制相當于80%、100%和120%的對照品溶液，加入規定量的內標溶液， 配成3種不同濃度的溶液，分別至少進樣2次， 計算平均校正因子，其相

11、對標準偏差應不大于2.0%。3.測定法（1） 內標法 按各品種正文項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液， 各精密量取適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。 取一定量進樣，記錄色譜圖。 測量對照品和內標物質的峰面積或峰高， 按下式計算校正因子： 式中  AS為內標物質的峰面積或峰高； AR為對照品的峰面積或峰高； cS為內標物質的濃度； cR為對照品的濃度。再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，進樣，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量： 式中 AX為供試品的峰面積或峰高； cX為供試品的濃度； A's為內標

12、物質的峰面積或峰高； c'S為內標物質的濃度； f為內標法校正因子。 采用內標法，可避免因供試品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。（2）外標法 按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液， 分別精密取一定量，進樣，記錄色譜圖， 測量對照品溶液和供試品溶液中待測物質的峰面積（或峰高）， 按下式計算含量： 式中各符號意義同上。 由于微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定時， 以手動進樣器定量環或自動進樣器進樣為宜。（3）加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取待測物質對照

13、品和參比物質對照品各適量，配制待測物校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖， 按下式計算待測物的校正因子：校正因子= 式中 cA為待測物的濃度； AA為待測物的峰面積或峰高； cB為參比物質的濃度； AB為參比物質的峰面積或峰高。也可精密稱（量）取主成分對照品和雜質對照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進樣，記錄色譜圖，繪制主成分濃度和雜質濃度對其峰面積的回歸曲線，以主成分回歸直線斜率與雜質回歸直線斜率的比計算校正因子。校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質的實測峰面積。需作校正計算的雜質，通常以主成分為參比，采用相對保留時間定位，其數值一并載入各品種項下。測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜

14、質限度， 將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液，作為對照溶液；進樣，記錄色譜圖， 必要時，調節縱坐標范圍（以噪聲水平可接受為限）使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量 程的10%25%。除另有規定外，通常含量低于0.5%的雜質，峰面積的相對標準偏差（RSD）應小于10%； 含量在0.5%2%的雜質，峰面積的RSD應小于5%； 含量大于2%的雜質，峰面積的RSD應小于2%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣，除另有規定外，供試品溶液的記錄時間，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，計算各雜質含量。（4） 不加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質含量時，若無法獲得待測物質的校正因子，或校正因子可以忽略， 也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照溶液、進樣調節縱坐標范圍和計算峰面積的相對標準偏差