1、古桂遺傳多樣性與親緣關系的ISSR分析段一凡，王賢榮* 作者簡介：段一凡（1984-），男，博士，主要從事樹木學研究；*通訊作者：王賢榮（1966-），教授，博士生導師，主要從事植物分類學和植物資源學研究，梁麗麗，李雪霞，向其柏，趙正萍(南京林業大學森林資源與環境學院，南京，210037)摘要：利用ISSR分子標記，以云南木犀(Osmanthus yunnanensis (Franchet) P.S.Green)和柊樹（Osmanthus heterophyllus （G.Don.）P.S.Green）為對照種，對6個省市45份古桂花和2份野生桂花進行了遺傳多樣性研究。結果表明：古桂花具有豐富

2、的遺傳多樣性，選用的14條引物共擴增出148條DNA條帶，其中多態性條帶131條，占88.51%；平均觀察等位基因數、有效等位基因數、Neis遺傳多樣性指數和Shannon多樣性信息指數分別為1.8851、1.4106、0.2415和0.3688；聚類分析結果表明對照種與桂花遺傳距離較遠，最早分開；古桂花具有很強的地理相關性，來自同一來源地或具有相似顏色的個體往往聚在一起；四季桂與其他秋桂類個體遺傳距離較遠。關鍵詞：古桂；ISSR；遺傳多樣性；聚類分析中圖分類號：S792.95；TQ920.1Analysis of genetic diversity and relationships amo

3、ng ancient sweet osmanthus trees using ISSR markersDUAN Yi-fan,WANG Xian-rong ,LIANG Li-li,LI Xue-xia,QIANG Qi-bai,ZHAO Zheng-pin（College of Forest Resources and Environment, Nanjing Foresty University,Nanjing,210037)Abstract: Interspecific relationships of 45 ancient sweet osmanthus trees from 6 pr

4、ovinces and 2 wild species of sweet osmanthus were evaluated by using ISSR (inter simple sequence repeat) marker with Osmanthus yunnanensis (Franchet) P.S. Green and Osmanthus fordii Hemsl as contrast species. The results showed that ancient sweet osmanthus trees had abundant genetic diversity. Four

5、teen ISSR primers produced a total of 148 bands, of which 131 were polymorphic. The percentage of polymorphic bands was 88.51%. The mean observed number of alleles, effective number of alleles, Neis genetic distance and Shannon index were 1.8851, 1.4106, 0.2415 and 0.3688 respectively. The cluster a

6、nalysis showed that the genetic distance between contrast species and sweet osmanthus was far. Ancient sweet osmanthus trees were closely correlated with geographical locations, and trees from the same place or in similar color often clustered together. The genetic distance between Asiaticus Group a

7、nd others was far. Key words: ancient sweet osmanthus trees, ISSR, genetic diversity, cluster analysis桂花Osmanthus fragrans (Thunb.) Lour.屬木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus Lour.)植物，為我國十大傳統名花之一，在我國已有2500余年的栽培歷史1。桂花是長壽樹種，在我國很多地方都有樹齡超過100年的古桂存在2。中華古桂是中國古老文明的象征，是活的文物標本，也是研究古氣候、古環境、古樹種質資源以及桂花新品種培育的重要材料，同時還是重要的旅

8、游資源3。桂花遺傳多樣性研究已多有報道，但研究材料幾乎都為新近培育的栽培品種，針對古桂的遺傳多樣性研究還十分有限，其分子層面研究還未見報道2-15。ISSR（inter simple sequence repeat）即簡單重復序列區間，是一種基于PCR擴增的分子標記技術。具有穩定性好、多態性高、實驗操作簡單快速等特點，而且ISSR標記可以揭示整個基因組的一些特征，不受季節、環境等外在因素的影響。目前已被廣泛用于作物遺傳育種、植物品種鑒定、基因定位和遺傳圖譜構建等研究中，是木本植物遺傳多樣性分析中的主要技術手段之一16-22。本研究以木犀屬的云南木犀(Osmanthus yunnanensis

9、(Franchet) P.S.Green)和柊樹（Osmanthus heterophyllus （G.Don.）P.S.Green）為對照種，以來源于全國6個省市45株古桂花和2份野生桂花為研究對象，采用ISSR分子標記對上述實驗材料進行了遺傳多樣性分析，旨在進一步探討桂花品種群及品種的親緣關系和遺傳演化，為古桂種質資源的有效保護、桂花新品種的培育和遺傳改良提供理論依據。1. 材料和方法1.1 材料2009年9月-2011年3月，在全國6個省市共調查了45株古桂（表1），采集古桂的無病蟲害的幼嫩葉片裝入自封袋中，并裝入硅膠干燥，-20度冰箱保存備用。作為對照的云南木犀(Osmanthus y

10、unnanensis (Franchet) P.S.Green)以及2份野生桂花采自浙江金華，柊樹（Osmanthus heterophyllus （G.Don.）P.S.Green）采自南京林業大學。實驗材料經專家鑒定，確切可靠。1.2 實驗方法DNA提取，采用張博等的CTAB-硅珠法23，稍作改進。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，經紫外分光光度計測定純度后，最終用TE稀釋至約20ng.ul-1。引物根據加拿大British Columbia大學公布的序列設計，參照前人研究11-13，由上海捷瑞（Generay）公司合成。篩選出14條擴增條帶較多，背景清晰的引物用于ISSR-PCR反

11、應。ISSR反應條件經過篩選和優化確定為25L反應體系：DNA模板40ng，10mol/L的引物1.2L，Mix（為混勻好的Taq酶、Mg2+和dNTP，購自上海Generay）12.5L，雙蒸水補充至25L。擴增程序為：94預變性5min；94變性1min，50-57復性1min，72延伸1.5，進行40個循環，最后72延伸8min。ISSR-PCR產物在含有溴化乙錠EB（0.5ug/ul）的1.5%瓊脂糖上電泳，100V恒壓電泳近2個小時，電泳結束于紫外凝膠成像系統拍照。表1 49份實驗材料概況Tab.1 Basic information of 49 materials編號No.名稱Na

12、me樹齡age采集地origin編號No.名稱Name樹齡age采集地origin1四季桂300浙江金華湯溪鎮26波葉銀桂035180湖北咸寧桂花鎮2結籽銀桂260浙江金華安地鎮27波葉銀桂047100湖北咸寧桂花鎮3結籽銀桂200浙江金華安地鎮28波葉銀桂023150湖北咸寧桂花鎮4金桂600江蘇鎮江儒里29波葉銀桂030180湖北咸寧桂花鎮5籽銀桂100上海植物園30波葉銀桂021500湖北咸寧桂花鎮6蘇州早黃135蘇州博物館31波葉銀桂045100湖北咸寧桂花鎮7蘇州早黃130蘇州南林賓館33波葉銀桂046180湖北咸寧桂花鎮8蘇州早黃235蘇州老防疫站33丹桂300湖北武穴9波葉金桂3

13、00蘇州南園賓館34丹桂01200四川成都龍藏寺10波葉金桂170蘇州圖書館35丹桂02200四川成都龍藏寺11波葉金桂150蘇州博物館36金桂01300四川成都郫縣12波葉金桂150蘇州南園賓館37金桂02300四川成都郫縣13金球桂270蘇州老防疫站38金桂03300四川成都郫縣14金球桂120蘇州南林飯店39金桂04300四川成都郫縣15金球桂115蘇州南林飯店40金桂05300四川成都郫縣16銀桂300蘇州南園賓館41金桂06300四川成都郫縣17波葉銀桂043135湖北咸寧桂花鎮42銀桂07300四川成都郫縣18波葉銀桂044100湖北咸寧桂花鎮43銀桂08300四川成都郫縣19麩金

14、200湖北咸寧桂花鎮44古桂2000陜西漢中圣水寺20江南麗人031200湖北咸寧桂花鎮45丹桂1700陜西漢中武侯墓21江南麗人033150湖北咸寧桂花鎮46野生桂（銀桂）1浙江金華22江南麗人042150湖北咸寧桂花鎮47野生桂（銀桂）2浙江金華23江南麗人120湖北咸寧桂花鎮48云南木犀浙江金華24柳葉桂100湖北咸寧桂花鎮49柊樹 江蘇南京25銀星100湖北咸寧桂花鎮 注：樹齡來自調查時獲得的相關信息及各地古樹名木志記載1.3 實驗數據處理方法ISSR為顯性標記，視每條多態性為一個等位基因。根據各分子標記電泳譜帶的有無統計所有的二元數據：有帶的記為“1”，無帶或模糊不清的記為“0”將數

15、據輸Excel表格，形成一個二元數據矩陣。根據這個二元數據計算多態位點百分數，采用POPGENE32 ( Version1. 31)，分別計算觀察等位基因數（Na）、有效等位基因數(Ne)、Neis遺傳多樣性指數(H)和Shannon多樣性信息指數(I)。采用類平均法(UPGMA)，使用NTSYSpc2.02軟件中的SHAN程序對實驗材料進行聚類分析。2. 結果與分析2.1 引物篩選和多態性分析參考前人研究，從36條引物中選出14條擴增條帶較多，信號強，背景清晰的引物用于ISSR-PCR反應（表2）。表2 14條ISSR引物擴增條帶數與多態性比率Tab.2 Number and ratio o

16、f polymorphic bands amplified by 14 ISSR primers引物Primer引物序列(53)Sequence(53)擴增帶數Amplified bands多態性條帶數Polymorphic bands多態性比率Polymorphic bands rate / %IBC810(GA)8T121191.67UBC811(GA)8C99100UBC813(CT)8T111090.91UBC815(CT)8G10990UBC825(AC)8T121191.67UBC836(AG)8YA1212100UBC841a(GA)8CC88100UBC844(CT)8RC87

17、87.5UBC844b(CT)8GC12975UBC853(TC)8RT7685.71UBC856(AC)8TC121191.67UBC857(AC)8YG10990ISSR12GA(GGA)5G10770ISSR27(TG)8CG151280合計Total14813188.5114條引物共擴增出148條DNA條帶，其中多態性條帶131條，平均多態性頻率達88.51%。擴增出的條帶大小在200-2000bp之間。每個引物 擴增的條帶數由7-15不等，平均每個引物擴增出10.57個條帶和9.36條多態性帶。多態性最高的達100%，最低的為70%，引物ISSR27擴增出的條帶數最多為15條，引物U

18、BC853擴增出的條帶最少為7條。引物UBC857和UBC844b，擴增的部分樣品的圖譜見圖1。由于ISSR揭示的是基因組DNA在酶切位點和其后的選擇性堿基的變異，從圖1可以看出，同一個體在不同引物產生了不同的ISSR產物圖譜，同一引物在不同單株間產生的擴增譜帶也不相同，這充分表現了供試古桂花在DNA水平上具有廣泛的差異。750bp2000bp500bp250bp1000bp圖1 引物UBC857 和 UBC844b 對部分古桂擴增產生的譜帶Fig.1 ISSR bands of some ancient sweet osmanthus with primer-UBC857 and prime

19、r-UBC844b2.2 古桂遺傳多樣性分析 觀察等位基因數（Na）、有效等位基因數(Ne)、Neis遺傳多樣性指數(H)和Shannon多樣性信息指數(I)是衡量遺傳多樣性水平的常用指標。將各古桂的ISSR擴增譜帶用POPGENE32進行分析，結果得出古桂的平均觀察等位基因數、有效等位基因數、Neis遺傳多樣性指數和Shannon多樣性信息指數分別為1.8851、1.4106、0.2415和0.3688。2.3 古桂的聚類分析根據49份實驗材料的Neis遺傳距離，利用UPGMA法進行聚類分析。從聚類圖（圖2）可以看出，作為對照種的野桂花(Osmanthus yunnanensis (Fran

20、chet) P.S.Green)和柊樹（Osmanthus heterophyllus （G.Don.）P.S.Green）與桂花遺傳距離較遠，二者最先分開，45份古桂和2份野生桂花聚為一個大類。從聚類圖可以看出，古桂表現出很強的地理相關性，相同地方來源的古桂常常集中聚在一起。如：6-16號來源于蘇州的古桂；17-31號來源于湖北咸寧的古桂；34-43號來源于四川成都的古桂分別聚類在一起。四季桂作為一個獨特的類群，其分類地位一直引人關注。從聚類圖可以看出，作為實驗樣本中唯一的一個四季桂個體，該樣本與其他古桂遺傳距離較遠。這同前人的研究結論一致，也再次證明四季桂與秋桂類的差異由來已久，且穩定可靠

21、。花色作為桂花品種分類的重要性狀一直受到肯定。從聚類圖可以看出相同品種、品種群或相似花色的個體常常聚在一起，如：6-8號；26-28號等。產于陜西漢中的兩棵“漢桂”(44和45號)與野生桂花(46號)聚在了一起，這不僅說明了這兩棵古桂起源的古老性和近野生性，也為我們了解野生桂花的自然分布和花色演化提供了新的線索。圖2 供試材料基于Neis遺傳距離的ISSR聚類圖Fig. ISSR dendrogram of cluster analysis based on Neis genetic distance for tested materials3. 結論與討論古桂的珍貴不僅僅是因其“古老性”和豐

22、富的文化背景，還在于它們是經過長期自然選擇和人工培育后所形成的獨特的、相對穩定的基因資源。由于古桂分布星散，數量稀少，且桂花為雄全異株花，所以其個體間近親繁殖的可能性很小，因而可以提供比較客觀的種質遺傳多樣性信息。本文應用ISSR分子標記對我國6個省市45株古桂的遺傳多樣性進行了研究。結果表明：古桂花具有豐富的遺傳多樣性，選用的14條引物共擴增出148條DNA條帶，其中多態性條帶131條，占88.51%；平均觀察等位基因數、有效等位基因數、Neis遺傳多樣性指數和Shannon多樣性信息指數分別為1.8851、1.4106、0.2415和0.3688；聚類分析結果表明古桂花具有很強的地理相關性

23、，這說明在交通并不發達的上百年前桂花跨地區引種的情況比較少，古桂花的引種栽培以小范圍、鄰近區域的引種為主。而另一方面桂花的遺傳多樣性又比較豐富，這說明桂花在長期的適應和進化中形成了比較豐富的遺傳變異，遺傳資源比較豐富。這些珍貴的種質資源對于桂花新品種繁育具有重要價值，因此加強古桂種質資源保護和利用具有重要意義。由于人類活動的不斷影響，野生桂花資源越來越難以尋覓，桂花的自然分布區域越來越碎片化。野生桂花作為一種重要的種質資源變得極度稀缺。聚類分析中古漢桂與野生桂花聚在了一起，這說明古桂有很強的近野生性或半野生性，這給我們了解野生桂花分布，研究桂花品種群花色演變，開展野生桂花種質資源搜集保護提供了

24、重要線索。遺傳多樣性對于物種適應環境變化及進化發展都具有重要意義。根據古桂遺傳多樣性較高的特點，在對桂花進行開發利用過程中應盡可能地對古桂實施保護，以保護其獨特的基因資源，積極開展古桂無性繁育和復壯技術研究，實現種質資源的異地保育和持續利用，使桂花的遺傳多樣性水平更好的保持和提高。 致謝：感謝南京森林警察學院偵查系謝春平博士、浙江金華華安園林苗木開發有限公司鮑志賢先生、湖北咸寧林科所劉恒貴所長、劉清平高級工程師、王啟富干事以及四川成都香王園林有限公司王思明先生在采樣過程中所給予的熱情幫助，感謝南京林業大學森林資源與環境學院夏濤老師在試驗中所給予的熱心指導。參考文獻：1 向其柏,劉玉蓮.中國桂花

25、品種圖志M.杭州:浙江科學技術出版社,2008.2 段一凡,王賢榮,梁麗麗,等.我國古桂研究現狀及桂花品種起源和演化初探.湖北民族學院學報(自然科學版),2010,28（4）:375-379 3 孫衛邦,向其柏.云南古桂的資源現狀及保護利用J.南京林業大學學報(自然科學版), 2004, 28(增刊): 94-96.4 陳建業,寧玉霞,趙翠華,等.河南桂花品種過氧化物酶同功酶研究J.園藝學報,1995,22(2):176-180.5 趙小蘭,姚崇懷,王彩云.桂花品種的同工酶研究.華中農業大學學報,2000,19（6）:595-599.6 朱誠,劉非燕.RAPD 技術與桂花品種分類和鑒定J.廣西

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