1、Biological Characteristics of ChlamydosporeProduction by Gliocladium virensQIAO Tia n2min1,ZHU Tia n2hui1,LI Fa ng2lia n1,LIU Fu2ping1,ZHANG Yu2hong2(1.College of Forestry and Horticulture,Sichuan Agricultural University,Y aan625014,Sichuan,China;2.Forestry Bureau of Nanchuan City,Nanchuan408400,Cho

2、ngqing,ChinaAbstract:Factors influencing chlamydospore production of Gliocladi um vi rens and characteristic of the spore are studied.The optimal medium for chlamydospore production of G.vi rens is potato2dextrose liquid which is screened out from8kinds of mediums.In PD medium,the optimum culture co

3、nditions are p H3,30,rotating in the light.The acid environment greatly enhances chlamydospore forma2 tion and inhibited production of conidia entirely,and the numbers of chlamydospore production are 8100×106chlamydospores/mL in these conditions for a week;Studies of chlamydospore germinating s

4、how:The optimum germination p H value was p H68and the optimum temperature of germination is25;the germinating rate can reach above90%after48hours;the optimal temperature for storing is under5.K ey w ords:Gliocladi um vi rens;chlamydospore;biological control;biological characteristics綠粘帚霉(Gliocladi

5、um vi rens厚垣孢子的生物學特性譙天敏1,朱天輝1,李芳蓮1,劉富平1,張毓紅2(1.四川農業大學林學園藝學院,四川雅安625014;2.南川市林業局,重慶南川408400摘要:主要研究綠粘帚霉厚垣孢子的誘導因素及其生物學特性。營養條件和生態因子試驗表明,PD為綠粘帚霉產厚垣孢子的最佳培養基,厚垣孢子產生的最適培養條件為:光照、振蕩、p H3、30,在此條件下可完全抑制其分生孢子的產生,并在1周內可產生厚垣孢子8100×106個/mL;厚垣孢子萌發試驗顯示,25、p H為68為綠粘帚霉厚垣孢子的最佳萌發條件,48h時可達90%以上的萌發率,在5下貯存比較適宜。關鍵詞:綠粘帚霉

6、,厚垣孢子,生物防治,生物學特性在一些真菌的菌絲中經常能見到不規則的肥大的菌絲細胞,一般是在不良環境條件下,菌絲細胞內的原生質收縮,變圓,外面形成一層厚壁,以抵抗不良環境,表面一般具有刺或瘤狀突起,這種結構稱為厚垣孢子。Caldwell于1958年首次觀察到厚垣孢子在土壤中比分生孢子更容易存活。在無隔菌絲中,菌絲的一部分有時集中儲藏養料,同時分泌厚壁,兩端形成全封閉的隔膜而與菌絲其他細胞切斷,形成厚垣孢子;而在有隔菌絲的較老菌絲部位往往形成厚垣孢子,它們一旦遇到適宜的環境條件它們便萌發產生菌絲。綠粘帚霉(Gliocladi um vi rens是一種重要的生防頡抗菌,其厚垣孢子在存活等生物學方

7、面的潛力已得到認同1。Lewis2和Beagle-Ristaino3分別用G.vi rens的菌絲體制備物和發酵生物量用于防治一些蔬菜的立枯病,得出了比分生孢子處理更好的防治效果。G.vi rens的菌絲體和厚垣孢子在土壤中的增殖比分生孢子更好,并且萌發率也更高3,這為應用拮抗體進行生物防治找到了新的途徑。第24卷第2期2006年6月四川農業大學學報Journal of Sichuan Agricultural UniversityJ un.2006收稿日期:2006-03-01通訊作者(Corresponding author。厚垣孢子作為抵抗不良環境而休眠的生存結構,具有更容易大規模生產,

8、容易貯藏、施用和商品化及貨架壽命長等優點,能滿足作為生物農藥的要求,因此,綠粘帚霉大量厚垣孢子的誘導及其生物學特性的研究對該頡抗菌生物農藥商品化生產具有重要的實踐意義。1材料與方法1.1綠粘帚霉厚垣孢子的誘導分別配制查氏(NaNO32g,K2HPO41g,KCl 015g,MgSO4015g,FeSO40101g,蔗糖30g,蒸餾水1000mL、G orodkowa(NaCl5g,牛肉膏10g,葡萄糖215g,蛋白胨10g,蒸餾水1000mL、PD(去皮馬鈴薯200g,葡萄糖20g,蒸餾水1000mL、豆芽汁蔗糖(黃豆芽100g,蔗糖50g,蒸餾水1000mL、玉米粉(玉米粉6215g,蒸餾水

9、1500mL、大米粒(大米粒100g,蒸餾水1000mL、紅糖(紅糖35g,酵母浸出汁3g,KNO32g,蒸餾水1000mL、牛肉膏蛋白胨培養(牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,蒸餾水1000mL8種液體培養基。上述每種培養基,每瓶各裝100mL(500mL三角瓶,121滅菌30min后備用。將活化2d的綠粘帚霉(四川農業大學林木病理室提供平板用孔徑為015cm的打孔器打孔,每瓶接種一菌塊,每種培養基設4種處理:光照(14W,24h/d+振蕩(120 r/mim;光照(14W,24h/d+靜置;黑暗(用黑光紙包裹+振蕩(120r/min;黑暗(用黑光紙包裹+靜置;每種處理重復3次,在30

10、下培養20d后,觀察菌絲體形成情況和發酵液顏色的變化,收集厚垣孢子并計算發酵液厚垣孢子數/mL。對于產厚垣孢子最多的培養基在最佳條件下繼續培養30d后,測定發酵液中厚垣孢子數/mL。厚垣孢子的制備參照文獻4的方法,待菌絲叢產生大量的厚垣孢子后,用布氏漏斗濾取菌絲叢,放入盛有100mL無菌水的勻漿杯內,5000r/min勻漿3min,使菌絲體充分破碎。用血球計數器在顯微鏡下計算出每1mL懸浮液中厚垣孢子的含量。然后將上述勻漿液1000r/min離心10min,棄上清液,用硅藻土吸附離心杯底的厚垣孢子,放入4冰箱中保存備用。將PD培養基調p H別為:2,3,4,5,6,7,8,9,10共8個處理,

11、每種處理重復3次,滅菌后接種綠粘帚霉菌絲塊各一塊,在30、120r/min下,光照(14 W,24h/d振蕩培養7d后,觀察發酵液p H和顏色變化,收集厚垣孢子(同上,并測定發酵液中厚垣孢子數/mL。將PD培養基調p H為3,滅菌后接種綠粘帚霉菌絲塊一塊,在15、20、25、30、35共5個溫度分別光照(14W,24h/d振蕩(120r/min培養7d后,收集厚垣孢子(同上,測定發酵液中厚垣孢子數/mL。1.2影響綠粘帚霉厚垣孢子萌發因素的研究將制備的厚垣孢子粉劑分別置于4和25下貯存,經不同時間觀測其萌發率,具體方法是將厚垣孢子用蒸餾水配制成孢子懸浮液(512×107個/ mL,在

12、顯微鏡下鏡檢300個以上厚垣孢子,計算其萌發率。將厚垣孢子用蒸餾水配成孢子懸浮液(5131×107個/mL,分別在不同溫度條件下進行萌發試驗,計算不同溫度下的孢子萌發率;同時用鹽酸和氫氧化鈉調配成不同p H值的厚垣孢子懸浮液(25,測定孢子萌發率。將厚垣孢子配制成孢子懸浮液(5131×107個/ mL,置于25培養箱中,每隔4h檢測一次其萌發狀況,測定厚垣孢子萌發所需時間。2結果與分析2.1綠粘帚霉厚垣孢子的誘導條件的研究綠粘帚霉在八種不同培養基中呈現了不同的菌絲形態,發酵液呈現出不同的顏色和澄清度,培養基對厚垣孢子產生的影響如表1所示,只有牛肉膏蛋白胨培養基和G orod

13、kowa培養基沒有產生分生孢子,但產生的厚垣孢子也不多,而且所設置的4種培養條件對分生孢子的產生沒有影響。而在光照和振蕩條件下,PD培養基產生了最多的厚垣孢子(1150×106個/mL,豆芽汁培養基其次(1115×106個/ mL,但同時也產生了大量的分生孢子,其次為豆芽汁、大米粒、查氏培養基,其他組合條件下,PD培養基產厚垣孢子也處于前兩位,綜合上述因素,作者認為PD培養基為產厚垣孢子的最佳培養基。761第2期譙天敏(等:綠粘帚霉(Gliocladium virens厚垣孢子的生物學特性表1綠粘帚霉在不同培養基中不同培養條件下的厚垣孢子和分生孢子的產生量(×10

14、4個mL-1 Table1The numbers of chlamydospore and conidium produced by GV under differentcultural medium and conditions(×104chlamydosporesmL-1培養基種類Media光照+振蕩Light+rotation黑暗+振蕩Dark+rotation光照+靜置Light+still黑暗+靜置Dark+still牛肉膏蛋白胨培養基Beef extract peptide medium 2.73(-gA1.7(-fB0.7(-cdC0.7(-cdC查氏培養基Cazpek

15、 medium40(+dA 6.7(+dC12.5(+aB 2.3(+bD 玉米粉培養基Corn powder medium10(+eA5(+deB 1.5(+cC1(+cCD 紅糖培養基Sugar medium 2.5(+ghA5(+deB0(+cfC0(+deCPD培養基PD medium150(+aA27.5(+bB10(+bC5(+aD 豆芽汁培養基Bean juice medium115(+bA46.7(+aB0.3(+ceC0(+deCD 大米粒培養基Rice medium55(+cA17.5(+cB0(+cfC0(+deCG orodkowa培養基G orodkowa mediu

16、m9(-efA 1.7(-fB0.7(-cdBC0(-deBD 注:“-”無分生孢子;“+”少量分生孢子;“+”較多分生孢子;“+”大量分生孢子;“3”厚垣孢子數量。差異性檢驗(t<0105:小寫字母為培養基間比較;大寫字母為培養條件間比較,含不相同字母為差異性顯著,否則,為不顯著。Note:“-”no conidiospora;“+”a little conidiospora;“+”more conidiospora;“+”numerous conidios pora.“3”chlamydospore numberSignifcant test(t<0105:small lett

17、ers show difference comparisons among columns;capital letters show difference comparison among rows,the same letter shows difference is not significant,otherwise,significant.僅從外觀上看,光照和黑暗對菌絲的生長繁殖影響不大。在振蕩條件下,培養液的深層空氣充分,綠粘帚霉的菌絲在深層發酵液中形成了許多不同形態的菌絲體,而在靜置培養條件下,菌絲只在發酵液表面形成一層膜狀菌絲體。表1顯示在同一培養基條件下,光照和振蕩更有利于厚垣孢

18、子的產生,光照和振蕩是誘導厚垣孢子的最佳條件,在此狀態下, PD發酵液培養30d,每毫升含厚垣孢子可達2140×106個。黑暗振蕩次之,黑暗靜置對厚垣孢子的產生無實際意義。作者認為,在振蕩條件下,可以看到許多菌絲形成了球狀或餅狀的菌絲體,使菌絲體內部形成了厭氧環境,對于耗氧菌綠粘帚霉來說,正是這種惡劣的厭氧環境誘導它產生了厚垣孢子,這與文獻4中誘導厚垣孢子產生所創造的厭氧環境相一致。p H對厚垣孢子產生的影響如表2所示。PD培養液的p H只有在2和3時,綠粘帚霉不產生分生孢子;當p H為10時,有大量的分生孢子產生(瓶壁綠色分生孢子,而厚垣孢子的量卻達到了最小值(1157×

19、105個/mL;當p H為3時,綠粘帚霉產生了最大量的厚垣孢子(8100×106個/mL。培養液的p H為3時,大大地刺激了厚垣孢子的產生,同時抑制了分生孢子的產生,而當p H為9和10時,卻刺激了分生孢子的產生,也抑制了厚垣孢子的產生。表2不同pH對綠粘帚霉厚垣孢子和分生孢子產生的影響Table2The effect of various p H on chlamydospore andconidium producted by GVp H發酵液p H變化p H change ofculture liquid厚垣孢子數(×104個mL-1Chlamydospore num

20、ber 2253.33(-h3 3.8800(-a46400(+b7 6.590(+d8 6.5243(+c9746(+i自然 6.883(+ef注:“-”無分生孢子;“+”少量分生孢子;“+”較多分生孢子;“+”大量分生孢子;“3”厚垣孢子數量。含不相同字母為差異性顯著,否則,為不顯著(t<0105。Note:“-”no conidiospora;“+”a little conidiospora;“+ +”more conidiospora;“+”numerous conidios pora;“3”chlamydospore number.the same letter shows d

21、ifference is not significant,otherwise,significant.不同溫度對綠粘帚霉厚垣孢子產生的影響見圖1,溫度較高有利于厚垣孢子的產生,30是綠粘帚霉產生厚垣孢子的最佳溫度。很明顯,厚垣孢子的861四川農業大學學報第24卷產生是綠粘帚霉在高溫環境下的一種重要的生存方式,這與Trione 5和Englander 6的觀點相一致 。圖1溫度對厚垣孢子產生的影響Fig1The effect of the temperature on chlamydospore producted by GV2.2不同環境條件對厚垣孢子萌發的影響貯存溫度、時間對厚垣孢子的活力影

22、響如圖2所示,綠粘帚霉厚垣孢子在不同溫度下隨著貯存時間的延長,萌發率逐漸下降,在5下貯存8個月后,萌發率降到70%,而在25下貯存同樣時間后,萌發率下降得比較快,已降到25%,說明在5下貯存較為適宜 。圖2不同溫度下厚垣孢子貯存后的萌發率Fig 2The germinating rate of chlamydosporestored under different temperature不同溫度對綠粘帚霉厚垣孢子萌發的影響如圖3所示,綠粘帚霉厚垣孢子萌發的最適溫度為25,25時萌發率為92%,而溫度在15以下和35以上幾乎不萌發。圖4顯示了不同p H 值下綠粘帚霉厚垣孢子萌發的影響。厚垣孢子萌

23、發的最適p H 是68,該p H 范圍下的萌發率為83%90%。綠粘帚霉厚垣孢子萌發率與時間的關系如圖5,厚垣孢子在20h 內只有30%的萌發率,48h 后,萌發率可達到92%以上 。圖3不同溫度對厚垣孢子萌發的影響Fig 3The germinating rate of chlamydosporeunder different temperature圖4p H 值對厚垣孢子萌發的影響Fig 4The germinating rate of chlamydospore under different p H圖5厚垣孢子萌發率與時間的關系Fig 5The relationship between

24、 germinatingrate of chlamydospore and time3討論與結論Tsao 4先在25mL 液體培養基中接種培養,24h 后用手搖晃使從接種塊上長出的菌絲破裂成菌絲片斷,靜止培養一周,然后在培養液中加入100mL 滅菌水,使Phytophthora parasitica 菌絲叢沉沒在液體深層,23周后可以獲得大量的厚垣孢子,而分961第2期譙天敏(等:綠粘帚霉(Gliocladium virens 厚垣孢子的生物學特性生孢子在液體深層被抑制。作者按此方法誘導綠粘帚霉菌的厚垣孢子,卻未能達到目的,但將PD培養基調p H為3時,在光照和振蕩的條件下形成了大量的菌絲球后

25、,停止振蕩,這時菌絲球都沉沒在液體深層,靜止培養一周后作者獲取了大量厚垣孢子,并且完全抑制了分生孢子的產生。Cochrane7曾報道酸化的并含有葡萄糖和無機鹽的培養基可在短時間內誘導大量的厚垣孢子,那么p H為3的PD培養液恰如其分地驗證了此說法。在作者所選取的8種培養基中,產厚垣孢子最多的是PD培養基,其次為豆芽汁培養基,這與Englander6用V8肉湯和Sush2 ma8用洋蔥頭汁液誘導厚垣孢子的方法有些相似,蔬菜汁在誘導厚垣孢子方面顯示了一定作用。另外,隨著培養時間的延長,營養物質的耗盡,有利于厚垣孢子的產生,很明顯厚垣孢子是GV渡過惡劣環境的一種生存方式。厚垣孢子由于具有容易大規模生

26、產,容易貯藏、施用和商品化及貨架壽命長等優點,我們摸索了綠粘帚霉菌形成厚垣孢子的生態條件,但厚垣孢子只有在萌發成菌絲后才可發揮它的生防作用,Lums2 den9認為綠粘帚霉菌的厚垣孢子萌發后能產生生長代謝必需的酶,并通過產生膠霉毒素影響了絲核菌和腐霉菌的萌發和生長。因此我們又進一步研究了該菌的厚垣孢子萌發的最適條件,這為綠粘帚霉厚垣孢子的實用化提供理論基礎,但離體情況下獲得的萌發條件尚需在田間進行驗證。參考文獻:1Papavizas G C.Biological control of soil2borne fungal propagulesJ.A nn Rew Phytopath,1980,18:369-413.2Lewis J A.Effect of myceial preparations of T richoderma andGliocladi um on populations of Rhizoctonia solani and the inci2 dence of damping2offJ.Phytopathol,1985,75:812-817.3Beagle-Ristaino J E.Survival and proliferation of propagules ofT richoderma spp and Gliocladi um vi r