1、實(shí)驗(yàn)一 人類體細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與核型分析Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 熟悉人類外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法及染色體標(biāo)本的制備方法。2 熟悉人類染色體G顯帶標(biāo)本制備與分析。【實(shí)驗(yàn)原理】染色體是在顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。因此，必須獲得染色體標(biāo)本才能進(jìn)行檢查分析，通常情況下，都是利用外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行核型分析。正常情況下，人體外周血淋巴細(xì)胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞，使其恢復(fù)增殖能力。因此，可采取少量外周靜脈血，做短期培養(yǎng)，培養(yǎng)至72小時(shí)細(xì)胞

2、進(jìn)入增殖旺盛期，此時(shí)加入秋水仙素抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進(jìn)行核型分析。上述制備的染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋帶，表明每條染色體的特征。【實(shí)驗(yàn)用品】1采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機(jī)、刻度離心管、乳頭吸管、試管架、量筒、試劑瓶、載玻片、吹風(fēng)機(jī)、托盤(pán)天平、顯微鏡、鏡油、二甲苯、擦鏡紙、鑷子、燒杯、記號(hào)筆、玻片架、火柴、10ml注射器。2RPMI 1640液體培養(yǎng)基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（1

3、0mg/ml）、KCl低滲液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液（PH6.8）。32.5胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4酚紅、Giemsa染色液、1N鹽酸、1N氫氧化鈉。【實(shí)驗(yàn)步驟】一外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與分析1. 采血及接種培養(yǎng)1.1 在酒精燈火焰上，用滅菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素濕潤(rùn)至管壁。1.2 常規(guī)消毒后，采集外周靜脈血5ml，轉(zhuǎn)動(dòng)注射器使血液與肝素混勻。1.3 在超凈工作臺(tái)中，預(yù)先將RPMI 1640液體培養(yǎng)基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培養(yǎng)瓶中，再滴加25滴全血（6號(hào)針頭），

4、水平搖動(dòng)混勻。1.4 置37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中每天水平搖動(dòng)培養(yǎng)物12次，使血液均勻懸浮，再繼續(xù)培養(yǎng)。1.5 終止培養(yǎng)前24小時(shí)，加入秋水仙素，使終濃度達(dá)到0.2g/ml。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使秋水仙素混勻。繼續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)。2制片2.1 收集細(xì)胞時(shí)，去掉瓶塞，用乳頭吸管吸取培養(yǎng)液，充分混勻培養(yǎng)物，再將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中。2.2 1000 rpm離心8分鐘（注意先配平）。2.3 棄上清液，加入37預(yù)溫的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)混勻后，置37恒溫水浴箱低滲處理25分鐘。2.4 加入 1ml新配制的固定劑（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸

5、管小心吹打、混勻，1000rpm離心8分鐘。2.5 棄上清液，加入8ml固定劑，吹打細(xì)胞團(tuán)制成細(xì)胞懸液后，室溫下固定20分鐘。2.6 1000 rpm離心 8分鐘。2.7 棄上清液，重復(fù)固定一次。2.8 棄上清液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少適當(dāng)加入數(shù)滴新配制的固定劑，吹打細(xì)胞制成懸液。2.9 吸取少量細(xì)胞懸液，滴23滴于冰水浸泡過(guò)的載玻片上，吹散，氣干。2.10 將標(biāo)本置Giemsa染液中，染色8分鐘，水洗去浮色，氣干。2.11 顯微鏡下觀察染色體標(biāo)本分裂相的多少及分散情況。二人外周血淋巴細(xì)胞染色體G顯帶標(biāo)本制備與分析1. G顯帶染色體標(biāo)本制備1.1 常規(guī)制片后，將標(biāo)本置70烤箱中干烤2小時(shí)，自然冷卻

6、。1.2 取2.5胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45 ml生理鹽水，用 1N HCl或1N NaOH及酚紅調(diào)節(jié)胰酶溶液成紫紅色（PH6.87.2），置 37OC預(yù)溫。1.3 將玻片標(biāo)本放入胰酶溶液中處理2545秒鐘，不斷輕輕搖動(dòng)玻片，使胰酶作用均勻。隨著處理標(biāo)本數(shù)量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。1.4 取出染色體玻片標(biāo)本，置于37預(yù)溫的生理鹽水中，然后用蒸餾水沖洗玻片（或輕甩，除去多余的胰酶）。1.5 將玻片標(biāo)本放入37預(yù)溫的Giemsa染液中，染色510分鐘。1.6 自來(lái)水沖洗，氣干。1.7 顯微鏡觀察。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】一. 常規(guī)染色體核型分析1根據(jù)染色體的形態(tài)、大小及著絲

7、粒的位置，將染色體分為七組。A組染色體：包括13號(hào)染色體。長(zhǎng)度最長(zhǎng)，1號(hào)和3號(hào)染色體為中央著絲粒，2號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體。B組染色體：包括45號(hào)染色體，長(zhǎng)度次于A組；亞中央著絲粒染色體，短臂較短。C組染色體：包括612號(hào)和X染色體，中等長(zhǎng)度，亞中央著絲粒染色體。D組染色體：包括1315號(hào)染色體，具有近端著絲粒和隨體。E組染色體：包括1618號(hào)染色體，16號(hào)染色體著絲粒在 3/8處，17號(hào)和 18號(hào)染色體著絲粒約在 1/4處。F組染色體：包括19號(hào)和20號(hào)染色體，中央著絲粒。G組染色體：包括21號(hào)、22號(hào)和Y染色體，是染色體組中最小的，為近端著絲粒的染色體。21號(hào)和22號(hào)染色體具有隨體。

8、2繪圖：繪出在顯微鏡下觀察到的染色體。二G顯帶染色體標(biāo)本分析G帶顯示的正常人顯帶核型特征（見(jiàn)附圖1.1、1.2、1.3）A組染色體：包括13號(hào)染色體。長(zhǎng)度最長(zhǎng)，1號(hào)和3號(hào)染色體為中央著絲粒，2號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體。1號(hào)染色體短臂：在320條帶左右的分裂相上，近側(cè)段有兩條深帶，第2條深帶稍寬；在處理好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段可顯出34條淺染的深帶。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)的第1深帶為2區(qū)1帶，第2深帶為3區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：副縊痕緊貼著絲粒，染色深淺不一，其遠(yuǎn)側(cè)為一寬的淺帶，近中段與遠(yuǎn)側(cè)段各有兩條深帶，中段兩條深帶稍靠近，其中第2條染色較濃。此臂分為四個(gè)區(qū)，副縊痕遠(yuǎn)側(cè)的淺帶為2區(qū)1帶，中段第2深帶為3區(qū)1

9、帶，遠(yuǎn)側(cè)段第1深帶為4區(qū)1帶。2號(hào)染色體短臂可見(jiàn)四條深帶，中段的兩條深帶較靠近。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段兩條深帶之間的淺帶為2區(qū) 1帶。 長(zhǎng)臂：有 7條深帶，第 3和第4深帶有時(shí)融合。此臂分為 3個(gè)區(qū)第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶，第4和第5深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。3號(hào)染色體著絲粒區(qū)濃染短臂：在近側(cè)段可見(jiàn)一條較寬的深帶，遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)兩條深帶，其中遠(yuǎn)側(cè)的一條較窄，且著色較淺，這是區(qū)別3號(hào)染色體短臂的重要特征。近側(cè)段的深帶可分為兩條深帶。此臂分2個(gè)區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：一般在近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條較寬的深帶。在顯帶好的標(biāo)本上，近側(cè)段的深帶可分為兩條深帶，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為三條深帶。此臂分為2

10、個(gè)區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。B組染色體：包括45號(hào)染色體，長(zhǎng)度次于A組；亞中央著絲粒染色體，短臂較短。 4號(hào)染色體短臂：可見(jiàn)兩條深帶，近側(cè)深帶染色較淺，短臂只有一個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)均勻分布的四條深帶，在顯帶較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的兩條深帶可各自再分為兩條較寬的深帶。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)段第1和第2深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶，遠(yuǎn)側(cè)段的兩條深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。5號(hào)染色體短臂：可見(jiàn)兩條深帶，其中遠(yuǎn)側(cè)的深帶寬而且色濃，短臂只有一個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)段有兩條深帶，染色較淺，有時(shí)不明顯；中段可見(jiàn)三條深帶，染色較深，有時(shí)融合成一條寬的深帶；遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)二條深帶，近末端的一條著色較濃。此臂可分為3個(gè)區(qū)，中段第 2深帶

11、為 2區(qū)1帶，中段深帶與遠(yuǎn)側(cè)段深帶之間的寬闊的淺帶為 3區(qū) 1帶。C組染色體：包括612號(hào)和X染色體，中等長(zhǎng)度，亞中央著絲粒染色體。 6號(hào)染色體短臂：中段有一條明顯而寬闊的淺帶，其中近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條深帶，近側(cè)深帶緊貼著絲粒；在顯帶較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶又可分為兩條深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的明顯而寬闊的淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)五條深帶，其中近側(cè)的一條緊貼著絲粒，遠(yuǎn)側(cè)段末端的一條深帶著色較淺。此臂分為2個(gè)區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。7號(hào)染色體著絲粒濃染。短臂：有三條深帶，中段深帶著色較淡，有時(shí)不明顯；遠(yuǎn)側(cè)深帶著色濃寬，狀如”瓶蓋”。此臂分為2個(gè)區(qū)，遠(yuǎn)側(cè)段的淺帶為2區(qū)1帶。

12、長(zhǎng)臂：有三條明顯的深帶，遠(yuǎn)側(cè)近末端的一條深帶著色較淡，第2和第3深帶稍接近。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)第1深帶為2區(qū)二帶，中段的第2深帶為3區(qū)1帶。8號(hào)染色體短臂：有兩條深帶，中段有一條較明顯的淺帶，這是與10號(hào)染色體相區(qū)分的主要特征。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的淺帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)三條分界不明顯的深帶，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶著色較濃。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。9號(hào)染色體著絲粒濃染。短臂：近側(cè)段和中段各有一條帶，在顯帶較好的標(biāo)本上，中段可見(jiàn)兩條窄的深帶，此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)明顯的兩條深帶，副縊痕一般不著色，在有些標(biāo)本上顯現(xiàn)出特有狹長(zhǎng)的頸部區(qū)。此臂分為 3個(gè)區(qū)，近側(cè)的一條

13、深帶為2區(qū) 1帶，遠(yuǎn)出的一條深帶為3區(qū)二帶。10號(hào)染色體著絲粒濃染。短臂：近出段和中段各有一條深帶，在有些標(biāo)本的中段可見(jiàn)兩條深帶，但與8號(hào)染色體短行比較，其深帶的分界不夠清晰。此臀只有一個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)明顯的三條帶，近側(cè)的深帶較明顯，遠(yuǎn)側(cè)的兩條深帶較靠近，這是與8號(hào)染色體相鑒別的主要特征。此管分為2個(gè)區(qū)，近側(cè)段的一條深帶為2區(qū)1帶。11號(hào)染色體短臂：近中段可見(jiàn)兩條靠的很近的較窄的深帶在顯帶較差的標(biāo)本上，只能看見(jiàn)一條寬帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)有一條深帶，緊貼著絲粒遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)一條明顯的較寬的深帶，這條深帶與近側(cè)的深帶之間是一條寬闊的淺帶，這是與12號(hào)染色體相鑒別的一個(gè)明顯特征；在顯帶較好的標(biāo)

14、本上，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為兩條較窄的深帶，兩深帶之間有一條很窄的淺帶，一般極難辨認(rèn)，但它是一個(gè)分區(qū)的界標(biāo)，在有些標(biāo)本上近末端處還可見(jiàn)一條窄的淡色的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，上述遠(yuǎn)側(cè)兩條深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。12號(hào)染色體短臂：中段可見(jiàn)一條深帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)有一條深帶，緊貼著絲粒；中段有一條寬的深帶，這條深帶與近側(cè)深帶之間有一條明顯的淺帶，但與11號(hào)染色體相比較這條淺帶較窄，這是鑒別11號(hào)與12號(hào)染色體的一個(gè)主要特征；在顯帶好的標(biāo)本上，中段較寬的深帶可分為三條深帶，其正中的一條著色較濃；在有些標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的近端還可見(jiàn)12條染色較淡的深帶。此行分為2個(gè)區(qū)，中段正中的深帶為2區(qū)1帶。X染

15、色體其長(zhǎng)度介于7號(hào)和8號(hào)染色體之間。短臂：中段有一條明顯的深帶，如竹節(jié)狀。在有些標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段還可見(jiàn)一條窄的、著色淡的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)45條深帶，近中部的一條深帶最明顯。此臂分為2個(gè)區(qū)，近中段的深帶2區(qū)1帶。D組染色體：包括1315號(hào)染色體，具有近端著絲粒和隨體。13號(hào)染色體著絲粒濃染。長(zhǎng)臂：可見(jiàn)4條深帶，第1和第4帶較窄，染色較淡。第2和第3深帶較寬，染色較濃，此臂分為3個(gè)區(qū)，第2深帶為2區(qū)1帶，第3深帶為3區(qū)1帶。14號(hào)染色體著絲粒濃染。長(zhǎng)臂：近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有一條明顯的深帶，在處理好的標(biāo)本上，中段尚可見(jiàn)一條較淺的深帶。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)深帶為2區(qū)1帶，

16、遠(yuǎn)側(cè)深帶為3區(qū)1帶。15號(hào)染色體著絲粒濃染。長(zhǎng)臂：中段有一條明顯的深帶，染色較濃，有的標(biāo)本上，近側(cè)段可見(jiàn)l2條淡染的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。E組染色體：包括 1618號(hào)染色體，16號(hào)染色體著絲粒在 3/8處，17號(hào)和 18號(hào)染色體著絲粒約在 1/4處。16號(hào)染色體短臂：中段有一條深帶，較好的標(biāo)本上可見(jiàn)兩條深帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：中段和遠(yuǎn)側(cè)各有一條深帶，有時(shí)遠(yuǎn)側(cè)段的一條不明顯，副縊痕著色濃。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。 17號(hào)染色體短臂：有一條深帶，緊貼著絲粒。此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)一條深帶，這條帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，這條明顯而

17、寬的淺帶為2區(qū)1帶。 18號(hào)染色體短臂：有一條窄的深帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有一條明顯的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，兩深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。F組染色體：包括19號(hào)和20號(hào)染色體，中央著絲粒。19號(hào)染色體著絲粒及周?chē)鸀樯顜В溆酁闇\帶。短臂和長(zhǎng)臂均只有1個(gè)區(qū)。 20號(hào)染色體著絲粒區(qū)濃染。短臂：有一條明顯的深帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。長(zhǎng)臂：在中段和遠(yuǎn)側(cè)段可見(jiàn)12條染色較淺的深帶，有時(shí)全為淺帶。此管只有1個(gè)區(qū)。G組染色體：包括21號(hào)、22號(hào)和Y染色體，是染色體組中最小的，具近端著絲粒的染色體。21號(hào)和22號(hào)染色體具有隨體。21號(hào)染色體著絲粒區(qū)著色淺。與22號(hào)染色體相比較，其長(zhǎng)度比22號(hào)短。其長(zhǎng)

18、臂近側(cè)有一明顯而寬的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，其深帶為2區(qū)1帶。22號(hào)染色體著絲粒區(qū)染色濃。與21號(hào)染色體相比較，其長(zhǎng)度比21號(hào)長(zhǎng)；在長(zhǎng)臂上可見(jiàn)兩條深帶，近側(cè)的一條著色較濃而且緊貼著絲粒，近中段的一條著色淺，在有的標(biāo)本上不顯現(xiàn)。此臂只有1個(gè)區(qū)。 Y染色體長(zhǎng)度變化較大，有時(shí)整個(gè)長(zhǎng)臂被染色成深帶。在染色較好的標(biāo)本上，可見(jiàn)兩條深帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。圖1.1 G顯帶染色體核型圖1.2 G顯帶染色體核型分析圖1.3 正常男性G顯帶染色體模式圖【注意的問(wèn)題】1采血時(shí)不要加入太多的肝素，因?yàn)楦嗡睾窟^(guò)多時(shí)往往抑制淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。2培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液逐漸變黃色，說(shuō)明pH發(fā)生了較大變化，將不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，此時(shí)可加入適

19、量滅菌的1.4% NaHCO3溶液調(diào)整，或再加入23ml培養(yǎng)液的辦法來(lái)校正。3培養(yǎng)失敗的原因，一般有下述幾種：培養(yǎng)瓶及器材洗滌不符合要求；配制溶液的雙蒸水不符合要求；PHA和培養(yǎng)液的質(zhì)量有問(wèn)題，或培養(yǎng)液pH不符合要求；無(wú)菌操作不符合要求，發(fā)生污染；淋巴細(xì)胞對(duì)PHA反應(yīng)降低，致分裂相太少。4標(biāo)本質(zhì)量不佳的原因：秋水仙素的處理不當(dāng)，如秋水仙素的濃度不夠或處理時(shí)間不足，結(jié)果分裂相太少；如濃度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則使染色體過(guò)于縮短，難于進(jìn)行分析；低滲處理不當(dāng)，低滲處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞膜往往過(guò)早破裂，染色體丟失；如果低滲處理不夠，則染色體分散不佳，難以進(jìn)行計(jì)數(shù)分析；離心速度不合適，收集細(xì)胞時(shí)離心的速度太

20、低易丟失細(xì)胞，如果低滲后離心速度過(guò)高，往往使分裂相過(guò)早破裂，完整的分裂相減少；標(biāo)本固定不充分，如固定液不新鮮，或甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，結(jié)果染色體模糊，或殘留胞漿痕跡，使背景不清；玻片去污不徹底，冷凍不夠，使細(xì)胞懸液不能均勻附著以致細(xì)胞大量丟失，或染色體分散不佳。5制備G顯帶染色體標(biāo)本時(shí)，要嚴(yán)格控制胰酶消化時(shí)間，時(shí)間不足顯不出帶紋，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使染色體不規(guī)則或形成空泡狀。附 錄一、試劑及配制：1、 RPMI1640培養(yǎng)液RPMI1640 10.4g肝素 80mgPHA 182mg胎牛血清 100ml抗菌素 8萬(wàn)單位NaHCO3 2g雙蒸水定容至1000ml。抽濾除菌，分裝，-200C保存待用。2

21、、 低滲液（0.075Mol KCl）KCl 2.794 g三蒸水 500ml3、 固定液甲醇（AR）：冰醋酸（AR）=3：1 現(xiàn)用現(xiàn)配。4、 Giemsa染液貯存液 Giemsa 5g純甘油（AR） 330ml甲醇 （AR） 33ml先將Giemsa粉劑溶于少量的甘油中，在研缽中充分研磨至無(wú)顆粒粘糊狀，再將全部甘油加入，然后移至燒杯中，在5560OC溫箱中放置2小時(shí)，冷卻后加入甲醇，充分?jǐn)嚢杈鶆颍谑覝胤胖?3周后過(guò)濾除去絮狀物，儲(chǔ)存在棕色瓶中，一般放置3周后使用效果更好。使用液磷酸緩沖液甲、乙各2.5ml，加45ml雙蒸水，加Giemsa原液2.5ml。5、 2.5%胰蛋白酶原液 胰蛋白酶

22、粉劑 2.5g 生理鹽水 100ml 6、 秋水仙素（10mg/ml，使用液100g/ml） 秋水仙素 1g 生理鹽水 100ml 抽濾，4OC棕色瓶保存。7、 肝素（2500U/ml，使用濃度50U/ml）肝素鈉 312.5 mg生理鹽水 100ml 高壓滅菌。8、 Hanks液（g/L）NaCl 8.00KCl 0.40CaCl2 0.14MgSO47H2O 0.20Na2HPO4 0.06KH2PO4 0.06NaHCO3 0.35葡萄糖 1.00酚紅 0.02二、記錄和檢查回報(bào)表表1 染色體病病例檢查分析記錄送檢材料： 檢查目的： 送檢時(shí)間：編 號(hào)： 送 檢 者： 院 科 醫(yī)生患者姓名

23、： 性 別： 年 齡：臨床檢查摘要于臨床初步診斷：家系資料： 表2 染色體檢查記錄（記錄內(nèi)容：顯微鏡號(hào)、標(biāo)本號(hào)、座標(biāo)、核型與異常特點(diǎn)）123456789101112131415 161718192021222324252627282930313233343537373839404142434445464748485051525354555657585960616263646566676869707172737475767778798081828384858687888990919293949596979899100表3 染色體畸變分析記錄玻片號(hào)性別號(hào)座 標(biāo)核 型畸變?nèi)旧w特點(diǎn)照片編號(hào)討 論：分

24、析結(jié)果： 分析者： 年 月 日表4 核型分析 1 2 3 4 5 A B 6 7 8 9 10 11 12 X C 13 14 15 16 17 18 D E 19 20 21 22 Y F G表5核型分析檢查回報(bào)單姓 名性 別年 齡送檢材料送檢目的時(shí) 間編 號(hào)送檢者院 科 醫(yī)生臨 床 初步 診 斷細(xì) 胞 遺傳 學(xué) 檢查 結(jié) 果（1）X染色質(zhì)檢查 Y染色質(zhì)檢查（2）核型分析（3）皮膚文理特征（4）家系分析診 斷 檢查者 簽字 年 月 日實(shí)驗(yàn)二X和Y染色質(zhì)標(biāo)本的制作與觀察X and Y Chromatin Preparation and Observation【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴煜染色質(zhì)和Y染色質(zhì)的

25、形態(tài)特征及其檢查方法【實(shí)驗(yàn)原理】正常女性核型為46，XX。在間期細(xì)胞核中緊貼核膜內(nèi)緣有一個(gè)染色較深的橢圓形小體，即X染色質(zhì)，這是女性細(xì)胞中一條X染色體隨機(jī)Lyon化失活形成的。這種失活保證了雌雄兩性細(xì)胞中都只有一條有活性的染色體，使兩性X連鎖基因產(chǎn)物的量保持在相同水平上。稱為X染色體的劑量補(bǔ)償（參考Lyon假說(shuō)）。正常男性核型為46，XY。在男性間期細(xì)胞核中，可見(jiàn)位于細(xì)胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點(diǎn)，就是Y染色質(zhì)（Y小體），大小約0.250.3m。是Y染色體長(zhǎng)臂特異性著色而形成。人的性別是由X和Y染色體決定的。需要對(duì)人的性別進(jìn)行鑒定時(shí)，除進(jìn)行染色體核型分析和臨床生殖器官的檢查外，還可

26、以通過(guò)細(xì)胞學(xué)方法，如檢查期間體細(xì)胞（口腔上皮，皮膚，羊水和血細(xì)胞等）的核內(nèi)染色質(zhì)X和Y染色質(zhì)來(lái)鑒定。【實(shí)驗(yàn)用品】顯微鏡、熒光顯微鏡、乙醇(無(wú)水乙醇,95,70、50)，甲醇，冰醋酸，硫堇，1結(jié)晶紫，1mol/L HCl。二甲苯、香柏油、擦鏡紙、蓋玻片、載片、15ml刻度離心管、牙簽、吸水紙、小鑷子、碘酒、酒精棉球、采血針、3醋酸溶液、pH66.5緩沖液、0.5鹽酸阿的平染液。（注：硫堇染液(工作液)，干液(硫堇)：硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中，溶解后過(guò)濾備用；醋酸鈉緩沖液：醋酸鈉·3H2O 9.7g，巴比妥鈉14.7g，溶于500mL蒸餾水中；0.1 molL鹽酸；按：

27、=40：28：32比例配成混合液，調(diào)pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。） 【實(shí)驗(yàn)步驟】一、X染色質(zhì)的制備和觀察（一）取材1. 讓受檢者用水漱洗口腔數(shù)次，以盡量除去口腔內(nèi)細(xì)菌或其它雜物。2.用牙簽鈍頭部或木質(zhì)器具刮取口內(nèi)側(cè)面的口腔粘膜上皮，棄去第一次刮到的細(xì)胞。3. 同一部位連續(xù)刮取數(shù)次，將刮取物涮入裝有生理鹽水的離心管內(nèi)。（二）標(biāo)本的制作1. 將細(xì)胞懸液的離心管進(jìn)行離心（1 500 rpm）10分鐘，去上清液，留下細(xì)胞團(tuán)。2. 加入新配制的固定液（3份甲醇1份冰醋酸）8mL，混勻呈懸液。固定30分鐘。3. 離心（同上），去上清液，留下細(xì)胞團(tuán)。4. 加入數(shù)滴（根據(jù)細(xì)胞多少而

28、增減）固定液，充分混勻呈懸液。5. 滴一滴懸液至預(yù)先置冰盒中的干凈載玻片上，晾干。每份樣本制片34張。（三）染色Klinger硫堇染色法1. 將玻片標(biāo)本置入1mol/L HCl中，37條件下水解20分鐘。2. 用蒸餾水充分沖洗、晾干。3. 硫堇染液中染色約15分鐘。4. 蒸餾水沖洗、晾干。硫堇染色的優(yōu)點(diǎn)是只有細(xì)胞核清晰著色，胞漿不著色，因此細(xì)胞核背景清晰，利于對(duì)位于核膜邊緣的X染色質(zhì)的辨認(rèn)。結(jié)晶紫的染色法1. 固定后的玻片標(biāo)本經(jīng)過(guò)70、50酒精及蒸餾水（更換兩次蒸餾水）各5分鐘。2. 置入1結(jié)晶紫溶液中染色58分鐘。大量制片時(shí)可用0.5結(jié)晶紫染液，染色1015分鐘左右。3. 95酒精中分化（快

29、速地在酒精中沾58次）。4. 繼續(xù)在無(wú)水乙醇中分化，間歇地用顯微鏡檢查，直至標(biāo)本中核結(jié)構(gòu)的微細(xì)部分都很清楚為止（一般約1分鐘）。5. 置入二甲苯中。更換2次二甲苯，每次3分鐘，以使標(biāo)本透明。6. 樹(shù)膠封片。（四）觀察1.先在低倍鏡(10倍鏡)下觀察，可見(jiàn)視野中有許多單個(gè)或成堆的口腔上皮細(xì)胞。選擇清楚而分散的細(xì)胞，移至視野中央，再換高倍鏡仔細(xì)觀察。口腔上皮細(xì)胞為多邊形的扁平狀，細(xì)胞中央有一被染成深蘭色的圓形或橢圓形的細(xì)胞核。核周?chē)|(zhì)部分為細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞的外表為一很難與細(xì)胞質(zhì)相區(qū)別的薄膜即細(xì)胞膜。2. 40倍或油鏡下檢查100個(gè)“可計(jì)數(shù)細(xì)胞”，并計(jì)數(shù)具有X染色質(zhì)的細(xì)胞數(shù)。二、Y染色質(zhì)的制片與觀察（

30、一）制作標(biāo)本1. 采血與涂片：男同學(xué)用碘酒，酒精棉球常規(guī)消毒食指或耳垂后，用采血針點(diǎn)刺食指或尖或耳垂，擠出23滴血于一干凈的底玻片中央，用牙簽將血滴涂成較厚的一層血膜，直徑約1.5cm，晾干。2. 固定：加3的醋酸溶液數(shù)滴于血膜上，靜置15分鐘，其間可換液一次，使紅細(xì)胞溶解。3. 用pH66.5磷酸緩沖液沖洗血膜，晾干。4. 染色：加0.5鹽酸阿的平溶液數(shù)滴于血膜上，放置暗處?kù)o置染色15分鐘。（若使用口服阿的平片劑，則用100mg溶于10ml雙蒸水中，染色時(shí)間為25分鐘）。5. 再用磷酸緩沖液沖洗黃色溶液。6. 加蓋玻片，在有緩沖液的情況下，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。（二）觀察Y染色質(zhì) 先在低倍鏡

31、下觀察，可見(jiàn)許多白細(xì)胞（多為淋巴細(xì)胞）核染成黃色。換高倍鏡，可見(jiàn)位于細(xì)胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點(diǎn)，就是Y染色質(zhì)（Y小體），大小約0.250.3m。最后可用油鏡再仔細(xì)觀察。Y染色質(zhì)在男性白細(xì)胞的出現(xiàn)率可達(dá)6070。注意需要計(jì)數(shù)的細(xì)胞必須是核膜完整無(wú)缺，核質(zhì)染色均勻，清晰可見(jiàn)，核周?chē)鸁o(wú)細(xì)菌和其它污染物質(zhì)的干擾。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】觀察并計(jì)算X染色質(zhì)的陽(yáng)性率。X染色質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)是：1. 位于核膜內(nèi)緣。2. 核內(nèi)唯一的濃染、輪廓清楚的小體，直徑約為11.5m,一般呈平凸形、圓形、扁平形或三角形。(注：配制的pH66.5的磷酸緩沖液要用黑紙或茶色瓶置于冰箱保存，有效期一個(gè)月。)實(shí)驗(yàn)三 姊妹染色單

32、體交換實(shí)驗(yàn)Sister Chromosome Exchange （SCE）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴煜ぶ苽銼CE標(biāo)本的原理和基本程序。【實(shí)驗(yàn)原理】姊妹染色單體交換（Sister chromatial exchange,SCE）是染色體同源座位上復(fù)制產(chǎn)物間的相互交換，是同一染色體的兩條單體之間發(fā)生的一類特殊的同源重組，主要在DNA合成期形成，可能與DNA雙鏈的斷裂與復(fù)制有關(guān)，SCE的發(fā)生的頻率可反映細(xì)胞在S期的受損程度。如果一個(gè)個(gè)體的SCE率明顯增高，可表明染色體受到環(huán)境中的一定因素的影響，或是受到遺傳缺陷的內(nèi)在制約因素所致。在細(xì)胞分裂時(shí)，每條染色體均有兩條染色單體組成，每條染色單體有一條雙鏈DNA組成。5

33、-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxy-uridine，BrdU）是脫氧胸腺嘧啶核苷的類似物，在DNA鏈的復(fù)制過(guò)程中，可替代胸腺嘧啶。當(dāng)細(xì)胞生存環(huán)境中存在BrdU時(shí)，BrdU取代脫氧胸苷摻入到復(fù)制的DNA中。經(jīng)兩個(gè)復(fù)制周期后，兩條姊妹染色單體中一條DNA的雙鏈均有BrdU摻入，而另一條DNA雙鏈中僅有一條鏈有BrdU摻入。利用特殊的分化染色技術(shù)對(duì)染色體標(biāo)本進(jìn)行處理，可使雙鏈均含有BrdU摻入的單體淺染，而只有一條鏈摻入BrdU的單體深染。當(dāng)姊妹染色體間存在同源片段交換時(shí)，可根據(jù)每條單體夾雜著深淺不一的著色片段加以區(qū)分。由于姐妹染色單體的DNA序列相同，SCE并不改變遺傳物質(zhì)組成，但SCE

34、是由于染色體發(fā)生斷裂和重接而產(chǎn)生的，因此，SCE顯示方法通常用來(lái)檢測(cè)染色體斷裂頻率，用來(lái)研究藥物和環(huán)境因素的致畸效應(yīng)。【實(shí)驗(yàn)用品】1. 超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、冰箱、離心機(jī)、顯微鏡、采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、刻度離心管、膠塞、乳頭吸管、試管架、載玻片、托盤(pán)天平、干燥烤箱、染色缸、電吹風(fēng)、30W紫外燈。2. 試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液、小牛血清、秋水仙素（100g/mL）、5-溴尿嘧啶（BrdU，200g/mL）、低滲液（0.075 mol/L KCL溶液）、2×SSC、Giemsa原液、甲醇、冰乙酸。【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 按半微量法采取外周靜脈血，接種培養(yǎng)。2. 37培養(yǎng)

35、24小時(shí)后，加BrdU溶液（終濃度為8g/mL）混勻。3. 用黑紙包裹培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。4. 收獲前加入秋水仙素（終濃度為0.2g/mL），繼續(xù)培養(yǎng)1小時(shí)。5. 常規(guī)法制片。將玻片標(biāo)本室溫放置23天。6. 分化染色前一天，將標(biāo)本置37過(guò)夜。7. 在平皿中平行放置兩根牙簽，將玻片放在牙簽上，加適量2×SSC溶液（以不超過(guò)標(biāo)本為度）。在標(biāo)本上蓋一張比玻片稍大的擦鏡紙，使紙邊浸入2×SSC溶液中，并使2×SSC溶液滲至玻片標(biāo)本上，保持標(biāo)本濕潤(rùn)。8. 將平皿置55水浴面上，用30W紫外燈垂直照射標(biāo)本30分鐘，照射距離10cm。9. 照射后輕輕取掉擦鏡紙，立即用蒸餾

36、水沖洗標(biāo)本。10. Giemsa染色510分鐘；蒸餾水沖洗標(biāo)本，氣干。11. 鏡檢，計(jì)數(shù)。每個(gè)末端交換記為1次SCE，中部交換記為2次SCE。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】觀察30個(gè)細(xì)胞的分裂相，記錄每個(gè)細(xì)胞的SCE總數(shù)，計(jì)算SCE頻率。n個(gè)中期分裂相SCE之和SCE頻率= n個(gè)細(xì)胞中國(guó)人正常SCE頻率為5.7±0.4。實(shí)驗(yàn)四銀染核仁形成區(qū)與近端著絲粒染色體隨體聯(lián)合AgNO3 Staining NOR and Satellite Association of Acrocentric Chromosome【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹渴煜ゃy染的原理和方法。【實(shí)驗(yàn)原理】人類近端著絲粒染色體的副縊痕與核仁形成有關(guān)，故稱

37、為核仁形成區(qū)（NOR）。當(dāng)位于此處的18S、28S核糖體RNA的基因（rDNA）具有轉(zhuǎn)錄活性時(shí)，應(yīng)用銀染技術(shù)可使NOR特異性著色（褐黑色）。進(jìn)一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成區(qū)特異的蛋白質(zhì)，即和rRNA轉(zhuǎn)錄相聯(lián)系的酸性蛋白。人類核糖體RNA基因位于5對(duì)近端著絲點(diǎn)染色體短臂的次猛痕處，即人類的核仁形成區(qū)。在正常人中， 不是所有核仁形成區(qū)均被銀染，其范圍大約4-10。應(yīng)用銀染法可以覺(jué)察正常人體核糖體RNA基因的活動(dòng)。此外，人類近端著絲粒染色體的隨體間易發(fā)生聯(lián)合，應(yīng)用銀染技術(shù)可在發(fā)生聯(lián)合的染色體間清楚地看到銀染物質(zhì)相連。因此，應(yīng)用銀染核仁形成區(qū)（Ag-NOR）與近端著絲粒

38、染色體隨體聯(lián)合（Ag-AA）技術(shù)，可以分析有活性的rRNA基因的動(dòng)態(tài)變化。正常人Ag-NOR平均為5.8/細(xì)胞。【實(shí)驗(yàn)用品】1. 恒溫水浴箱、顯微鏡、平皿、牙簽、擦鏡紙、鑷子；2. 預(yù)制染色體玻片標(biāo)本、0.1甲酸、AgNO3（50）。1：20 Giemsa,5mol/L HCl。【實(shí)驗(yàn)步驟】1. 按半微量法采取外周靜脈血，接種培養(yǎng)。常規(guī)法制片。將染色體玻片標(biāo)本在室溫下放置23天。2. 將標(biāo)本置入5mol/L HCl溶液中常溫處理5分鐘，蒸餾水沖洗2-3次，甩干。3將500mg AgNO3溶于1 ml 0.1甲酸溶液中，混勻后立即滴45（5ml）滴至玻片標(biāo)本上。4. 在平皿中平行放置兩根牙簽，將

39、玻片標(biāo)本放在牙簽上。5. 在標(biāo)本上蓋一張比玻片稍小的擦鏡紙，用鑷子掀動(dòng)紙片數(shù)次，使染液均勻分散在標(biāo)本上。6. 將平皿置于60水浴箱中處理3-5分鐘，直至擦鏡紙呈棕黃色終止反應(yīng)。7. 蒸餾水沖洗去擦鏡紙，以1：20 Giemsa染液復(fù)染3分鐘。水洗，氣干。8. 鏡下觀察。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析】1. Ag-NOR的計(jì)數(shù)：選擇銀染著色清晰的分裂相，計(jì)數(shù)6個(gè)D組（13、14、和15號(hào)染色體）和4個(gè)G組（21和22號(hào)染色體）近端著絲粒染色體，不論單側(cè)或雙側(cè)的銀染點(diǎn)都計(jì)數(shù)為一個(gè)有銀染的染色體。2. Ag-AA計(jì)數(shù)：凡近端著絲粒染色體之間有銀染物質(zhì)相連的，均計(jì)數(shù)為Ag-AA。涉及2條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，記為

40、1個(gè)Ag-AA；涉及3條近端著絲粒染色體的聯(lián)合，如未形成閉環(huán)的，記為2個(gè)Ag-AA；3條染色體聯(lián)合形成閉環(huán)時(shí)，記為3個(gè)Ag-AA；依此類推。N個(gè)核型中含NOR染色體數(shù)之和NOR均值= N個(gè)核型（注：避免AgNO3 溶液污染皮膚，否則將其染成褐黑色，很難洗掉。）實(shí)驗(yàn)五核酸提取The Extraction of Nucleic Acid【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握核酸提取的基本原理和基本方法2掌握檢測(cè)核酸濃度及純度的原理及方法【實(shí)驗(yàn)原理】DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學(xué)研究的主要對(duì)象,因此DNA的提取也應(yīng)是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的

41、工作，那就根本談不上進(jìn)行分子生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)。在DNA提取過(guò)程中應(yīng)做到：1、根據(jù)不同研究需要，保證結(jié)構(gòu)的相應(yīng)完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3、保證提取樣品中不含對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑及高濃度的金屬離子。核酸的提取關(guān)鍵是去除蛋白質(zhì)，通常情況下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機(jī)溶劑抽提，在單價(jià)陽(yáng)離子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。作DNA或RNA定量時(shí)，應(yīng)在260nm和280nm兩個(gè)波長(zhǎng)下讀數(shù)。在260nm的讀數(shù)用于計(jì)算樣品中的核酸濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50g/ml雙鏈DNA，40g/ml單鏈DNA或RNA及大約20g/ml單鏈寡核苷酸。根據(jù)

42、在260nm以及在280nm的讀數(shù)比值估計(jì)核酸的純度。DNA及RNA純品的OD260/OD280值分別是1.8和2.0，如果樣品中污染有蛋白或酚，其OD260/OD280將明顯低于此值，此時(shí)無(wú)法對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行精確定量。【實(shí)驗(yàn)用品】1臺(tái)式離心機(jī)；電熱恒溫水浴箱；冰箱；紫外分光光度計(jì)；一次性塑料手套。2微量加樣器（1000l,200l，20l）；Tip頭（1000l,200l，20l）。Tip頭盒（1000l,200l，20l）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。3DNA提取的相關(guān)試劑：1） 蛋白酶K（10mg/ml）,-20保存。2） TE（

43、pH 8.0）:10mmol/L Tris.Cl（pH 8.0）,1mmol/L EDTA（pH 8.0）,15磅高壓滅菌后室溫保存。3）10% SDS：10g SDS溶于90ml 水中，加熱68助溶，加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，加蒸餾水定容至100ml，室溫保存。4）3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。5）飽和氯化鈉，70%乙醇，氯仿6）飽和酚【實(shí)驗(yàn)步驟】飽和氯化鈉抽提法提取外周血DNA1取0.5ml抗凝全血，加入0.8ml TE(pH 8.0)混勻；2室溫離心，10000rpm ，1分鐘；3棄上清，加

44、入0.4ml TE(pH 8.0)， 混勻，懸浮細(xì)胞；4加入10mg/ml蛋白酶K 5l（終濃度100g/ml）,10% SDS 25l(終濃度0.5%)，混勻；537水浴消化過(guò)夜，或50消化4小時(shí)；6加入1/3體積的飽和氯化鈉，充分混勻，4靜置10分鐘；710000rpm離心10分鐘，取上清于另一新管中；8加入等體積氯仿，混勻，10000rpm離心10分鐘；9取上清于另一新管中，加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2)混勻；10加入2倍體積無(wú)水乙醇輕輕混合，10000rpm離心1分鐘；11棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；1210000rpm離心1分鐘，棄上清，自然干燥DN

45、A約5分鐘；13加入200-250l TE，-20保存；14檢測(cè)濃度及純度。酚氯仿抽提法提取外周血DNA1外周血反復(fù)凍溶破壞紅細(xì)胞，取0.5ml外周血，加入0.5ml PBS混勻后，10000rpm 離心10分鐘；2棄上清，加入180l TE(pH 8.0)，20l 10% SDS,10mg/ml蛋白酶K 5l（終濃度100g/ml）混勻；337水浴消化過(guò)夜，或50消化4小時(shí)；4加入等體積的飽和酚并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；5吸取上清液于另一新管中，重復(fù)上一步驟一次；6吸取上清液于另一新管中，加入等體積的酚氯仿并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；7吸取上清液于另一新管中，加

46、入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2) 混勻后，加入2倍體積無(wú)水乙醇并輕輕混合，可見(jiàn)絮狀乳白色DNA團(tuán)塊，10000rpm離心10分鐘；8棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；9. 10000rpm離心1分鐘，棄上清，自然涼干后加入TE液，-20保存；10檢測(cè)濃度及純度組織總RNA的提取 1. 將組織用錫箔紙包裹后于液氮中凍10min，擊碎后回收入2ml無(wú)菌Eppendorff管中。按50-100mg組織樣品加1ml TRIZOL試劑進(jìn)行組織勻漿,樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIZOL試劑體積的10%；2.將組織勻漿液在15-30放置5min,促使核蛋白復(fù)合物完全解離,按1ml TRIZO

47、L,加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,15-30放置2-3min,在2-8,離心轉(zhuǎn)速不超過(guò)12000g,離心15min,將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中(上清液約占TRIZOL試劑體積的60%)；3. 在上清液中按1mlTRIZOL試劑(最初勻漿體積)加入0.5ml異丙醇混勻,15-30放置10min,在2-8,離心轉(zhuǎn)速不超過(guò)12000g,離心10min；4.棄上清,70%乙醇洗滌RNA沉淀 (1ml TRIZOL試劑至少加入1ml 70%乙醇),振蕩混勻,在2-8,離心轉(zhuǎn)速不超過(guò)7500g,離心5min；5.室溫或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55-60溫浴10min).6.紫外分光光

48、度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度；7.1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA，每孔上樣25g，65V，2.5h，以檢測(cè)RNA的質(zhì)量。【實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析】1. 計(jì)算已提取的DNA的濃度和純度【思考題】1DNA提取還有哪些方法？2RNA提取中關(guān)鍵問(wèn)題是什么？實(shí)驗(yàn)六 DNA重組技術(shù)Recombinant DNA【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握DNA重組技術(shù)的基本原理和基本方法2熟悉質(zhì)粒DNA的小量制備及酶切鑒定方法【實(shí)驗(yàn)原理】1DNA重組技術(shù) 重組DNA(Recombinant DNA)技術(shù)是遺傳工程的核心技術(shù)，也是人類在基因和DNA分子水平進(jìn)行操作的技術(shù)。它包括以下幾個(gè)步驟：1） 重組DNA分子的構(gòu)建：即將目的基因（DNA

49、或cDNA片段）與載體DNA重組，應(yīng)用TA克隆方法,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物快速克隆至質(zhì)粒載體中。該方法利用了PCR過(guò)程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶(Taq酶)在所復(fù)制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A),從而產(chǎn)生一A-粘性末端的性質(zhì),設(shè)計(jì)一種線性載體,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR產(chǎn)物,在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。2） 將重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。3） 克隆選擇增殖：將轉(zhuǎn)化后的液體涂布于瓊脂培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應(yīng)抗生素的抗性基因，轉(zhuǎn)化的細(xì)菌能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成集落。挑取菌落，置液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，

50、得到大量含重組DNA的細(xì)菌。4） 收獲擴(kuò)增后的培養(yǎng)細(xì)胞，提取重組DNA分子（質(zhì)粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。圖2.1 TA克隆原理示意圖圖2.2 克隆選擇增殖原理示意圖2質(zhì)粒DNA的小量制備常見(jiàn)的質(zhì)粒DNA提取方法有簡(jiǎn)易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實(shí)驗(yàn)采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH 12.012.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒（CC）DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，將

51、可去除大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收質(zhì)粒DNA。3質(zhì)粒DNA的限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物體內(nèi)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能特性分為：、型。型切點(diǎn)不固定，型其切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外，只有型其特異性切點(diǎn)位置可以控制和預(yù)測(cè)，可以產(chǎn)生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均為型限制酶。這類酶的特點(diǎn)是具有能夠識(shí)別雙鏈DNA分子上的特異性核苷酸序列的能力，能在這個(gè)特異性核苷酸序列內(nèi)切斷DNA雙鏈，形成一定長(zhǎng)度和順序的DNA片段。選擇合適的限制酶對(duì)重組的環(huán)狀質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用已知相對(duì)分子量的線狀DNA（DNA分子量標(biāo)志）及未經(jīng)酶切的重組環(huán)狀質(zhì)粒為對(duì)照，可以對(duì)重組環(huán)狀質(zhì)粒中的目的DNA分子進(jìn)行初步鑒定。【實(shí)驗(yàn)用品】1PCR擴(kuò)增儀；恒溫振蕩培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)；細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱；臺(tái)式高速離心