1、老年醫學專業畢業論文 精品論文 人醛糖還原酶基因真核細胞表達模型的構建及中草藥醛糖還原酶抑制劑篩選關鍵詞：醛糖還原酶基因 真核細胞 中草藥醛糖還原酶抑制劑摘要：糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhib

2、itor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞

3、)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白表達，通過Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：GFP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中A

4、R的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒pHAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His

5、標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARISorbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模

6、型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥ARI篩選方面可以發揮積極的作用。正文內容 糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，

7、AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenflu

8、orescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白表達，通過Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：G

9、FP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒pHAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR

10、基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARISorbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定

11、基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥ARI篩選方面可以發揮積極的作用。糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)

12、激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應

13、用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白

14、表達，通過Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：GFP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒pHAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過Westernblot、紫外分光光度法觀察A

15、R和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷

16、、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARISorbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥ARI篩選方面可以發揮積極的作用。糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小

17、的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制

18、劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵

19、母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白表達，通過Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：GFP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒p

20、HAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞

21、蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARISorbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥ARI篩選方面可以發揮積極的作用。糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccompli

22、cation，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具

23、有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵

24、母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白表達，通過Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：GFP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR

25、，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒pHAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑

26、制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARISorbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥AR

27、I篩選方面可以發揮積極的作用。糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的A

28、RI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的

29、初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白表達，通過Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：GFP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋

30、白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒pHAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat

31、分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARISorbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，

32、初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥ARI篩選方面可以發揮積極的作用。糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代

33、謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：

34、GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白表達，通過Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：GFP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性

35、較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒pHAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋

36、白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARISorbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立

37、AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥ARI篩選方面可以發揮積極的作用。糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明

38、：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基

39、因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白表達，通過Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：GFP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示A

40、R酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒pHAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于

41、GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARISorbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因

42、的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥ARI篩選方面可以發揮積極的作用。糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，

43、醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將

44、基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白表達，通過Northernblot、Wester

45、nblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：GFP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒pHAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，

46、實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARIS

47、orbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥ARI篩選方面可以發揮積極的作用。糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多

48、元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的預防和治療具有重要的意義。中草藥ARI作為天然產物，無明顯不良反應，并可經過辨證施治，正確組方研制復方制劑，使抑制AR，降血糖，抗氧化，擴血管等多種功能

49、并存，因而在預防治療DCC方面顯示了良好的應用前景。 本研究是利用基因重組和基因轉導技術，將基因AR及攜帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescentprotein，GFP)的融合基因AR：GFP導入真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)，構建AR表達的蛋白分子模型和AR：GFP的細胞模型，研究AR在代謝中的地位，并應用該模型進行中草藥醛糖還原酶抑制劑(ARI)的初步篩選。 研究分為以下三個部分： (1)AR基因酵母細胞表達模型的構建：將含人AR基因的酵母重組質粒pYEX-BX-AR、pYEX-BX-AR：GFP(由本室前期構建并保存)，轉化酵母宿主菌INVSC1，分別命名為XAR、XAG菌

50、株。加入CuSO4(記為0hr)誘導目的蛋白表達，通過Northernblot、Westernblot，紫外分光光度法檢測AR、AR：GFP的基因表達、蛋白表達及AR酶活性。結果顯示AR酵母蛋白分子模型成功建立：AR細胞模型XAR菌株中AR的mRNA和蛋白均表達較好，AR活性較強(最高約為140U/g)；XAG菌株檢測到AR：GFP的mRNA和蛋白較好表達，但融合蛋白AR：GFP幾乎無AR活性。 (2)AR基因HEK293細胞表達模型的構建：將目的基因AR，AR：GFP重組克隆到真核表達載體pcDNA3.1/myc-HisA中，分別構建重組質粒pHAR、pHAG，瞬時轉染HEK293細胞，通過

51、Westernblot、紫外分光光度法觀察AR和AR：GFP在HEK293細胞中的表達情況，實驗結果與酵母細胞部分基本一致。結果顯示AR基因的HEK293細胞蛋白分子模型成功構建，基于GFP探針的AR：GFP細胞模型不太理想。并借助His標簽應用Ni-NTA磁珠得到純化AR蛋白。 (3)中草藥ARI的初步篩選：選用經典的ARISorbinil和Zopolrestat分別對上述兩個蛋白分子模型表達的細胞總蛋白AR活性進行抑制觀察，兩藥物的抑制結果一致表明：抑制效果呈藥物濃度依賴性關系，但對HEK293細胞中AR的抑制效果更佳。隨選用HEK293細胞蛋白分子模型進行中草藥ARI的初步篩選，篩選出具

52、有潛在ARI作用的中藥有效成分黃芩苷、虎杖苷、蕨麻多糖JM等，其AR抑制活性與經典的ARISorbinil基本相當，為進一步實驗研究奠定基礎。 本研究通過AR靶點，成功地構建了AR基因的真核細胞(酵母細胞/HEK293細胞)蛋白分子表達模型；借助GFP這一生物活分子探針，建立AR：GFP的細胞模型有待于進一步改進。將蛋白分子模型應用于中草藥ARI的簡單經濟高效篩選，初步篩選出可能具有潛在的防治DCC的幾種中草藥ARI。此AR蛋白分子模型靶點明確，在中藥ARI篩選方面可以發揮積極的作用。糖尿病慢性并發癥(Dialbeticchroniccomplication，DCC)是一個慢性病變過程，需要長期用藥，因而選擇療效確切、靶點清楚、副作用小的藥物來干預DCC的發展，臨床意義較大。糖代謝多元醇通路(Polyolpathway，PP)激活被認為是DCC的主要發病機制之一(附錄1)，醛糖還原酶(Aldosereductase，AR)為PP的主要限速酶。體外研究和動物實驗表明：AR抑制劑(Aldosereductaseinhibitor，ARI)可以有效地改善PP代謝異常，預防與延緩DCC，如眼部病變、腎臟病變、神經病變。多數前期臨床資料顯示：人工合成的ARI低劑量療效欠佳，高劑量副作用較大。因此尋找并篩選低毒高效的ARI，對DCC的