1、基因克隆原理及實驗介紹基因克隆原理及實驗介紹The principle and experiment of gene cloning中藥教研室內(nèi)容概要實驗進展匯報（5.108.24）基因克隆基本原理及實驗操作目的基因目的基因長度長度質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體備注備注結(jié)果結(jié)果NS1-11056bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功NS1-21056bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功NS1-31056bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功NS2A-1654bppcDNA3.1+3flag中間有2個位點突變成功NS2B-1390bppcDNA3.1+3fla

2、g不配對失敗NS2B-2390bppcDNA3.1+3flag雙峰失敗NS2B-3390bppcDNA3.1+3flag中間有1個位點突變成功NS3-11854bppcDNA3.1+3flag測序有問題，需要溝通NS3-21854bppcDNA3.1+3flag測序有問題，需要溝通NS3-31854bppcDNA3.1+3flag測序有問題，需要溝通NS4A-1859bppcDNA3.1+3flag需要重新設計引物，直接pcr成功NS4A-2859bppcDNA3.1+3flag需要重新設計引物，直接pcr成功NS4A-3859bppcDNA3.1+3flag需要重新設計引物，直接pcr成功N

3、S4B-1336bppcDNA3.1+3flag需要重新設計引物，重新實驗失敗NS4B-2336bppcDNA3.1+3flag需要重新設計引物，重新實驗失敗NS4B-3336bppcDNA3.1+3flag需要重新設計引物，重新實驗失敗NS5-12700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出來失敗NS5-22700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出來失敗NS5-32700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出來失敗E-31485bppcDNA3.1+3flag中間有4個位點突變成功Cap-1339bppcDNA3.1+3flag前后有數(shù)個位點突變成功Cap-2339bp

4、pcDNA3.1+3flag前后有數(shù)個位點突變成功Cap-3339bppcDNA3.1+3flag前后有數(shù)個位點突變成功prM-1498bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功prM-2498bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功prM-3498bppcDNA3.1+3flag中間有3個位點突變成功M-1225bppcDNA3.1+3flag中間有1個位點突變成功M-2225bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功M-3225bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功目的基因目的基因長度長度質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體備注備注結(jié)果結(jié)果NS3-11854bppcDNA3.

5、1+3flag有2個突變成功NS3-21854bppcDNA3.1+3flag有2個突變成功NS3-31854bppcDNA3.1+3flag有2個突變成功NS4A-1381bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功NS4A-2381bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功NS4A-3381bppcDNA3.1+3flag沒有突變成功NS4B-1744bppcDNA3.1+3flag有2個突變失敗NS4B-2744bppcDNA3.1+3flag有3個突變失敗NS4B-3744bppcDNA3.1+3flag有2個突變失敗NS4A+2K-1450bppcDNA3.1+3flagNS4A+

6、2K-2450bppcDNA3.1+3flagNS4A+2K-3450bppcDNA3.1+3flagNS5-32700bppcDNA3.1+3flagE1485bppcDNA3.1+3flagPCR做不出來失敗prM-1498bppLenti+3flag無信號，取消測序失敗prM-2498bppLenti+3flag沒有突變成功prM-3498bppLenti+3flag沒有突變成功M-1225bppLenti+3flagM-2225bppLenti+3flagM-3225bppLenti+3flag分子生物學DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄 分子生物學是在分子水平上研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、

7、生命活動及其規(guī)律的科學，其研究對象是核酸（DNA、RNA）和蛋白質(zhì)等生物大分子，其研究內(nèi)容包括核酸和蛋白質(zhì)等的結(jié)構(gòu)、功能及其遺傳信息和代謝信息傳遞中的作用和作用規(guī)律。基因克隆基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又稱為重組DNA技術(shù)，是應用酶學方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當?shù)乃拗骷毎羞M行擴增，形成大量的子代DNA分子的過程。目的：大量擴增目的基因，為下一步基因的功能研究做準備。pcDNA3.1+3flagpCR雙酶切連接引物設計回收純化重組質(zhì)粒pcDNA3.1+3flag-NS3pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序大腸桿菌(感受

8、態(tài))引物設計回收純化載體目的片段酶切鑒定網(wǎng)上檢索引物設計DNA制備PCR擴增擴增產(chǎn)物純化與克隆載體連接感受態(tài)E.coli制備轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)重組克隆篩選PCR或酶切鑒定測序生物信息學分析等質(zhì)粒提取實驗流程引物設計從 GenBank 下載全基因組序列（complete genome），記錄編號 保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）獲取載體質(zhì)粒的相關(guān)信息（抗性、標簽、酶切位點）復制到Primer Premier 5 分析其酶切位點，選擇共有的酶切位點在目的基因合適的位置添加引物，并在引物前/后加上酶切位點pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設計ori 是復制起點,他

9、被宿主細胞識別后才能在該細胞中復制。Primer Premier 5pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設計Primer Premier 5pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設計引物處理 Procedure標記，Sense F，Antise R ，如“NS3 Sense BamH1”，記為“NS3-F-BamH1”離心，使粉末在底部集聚，12000g，10min（注意是g，不是rpm）稀釋，ddH2O按報告單儲存濃度（100M）的10倍量稀釋至使用濃度10M保存，分裝-20pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設計Attention離心時待離心機達到最高轉(zhuǎn)速方可離

10、開，防止不平衡造成損壞M 是濃度單位，如100M=100mol/L引物稀釋量向上取5倍整數(shù)，如383l稀釋至385lpCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序引物設計1 預變性94 2min2c 變性98 10s3c 退火X 30s*4c 延伸68 需計算*5 總延伸68 10min6 冷卻16 10min總循環(huán)數(shù)30-40（from 2c to 4c）引物設計雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化pCR成分體積（l）滅菌dd H2O3310 KOD-plus-neo Buffer5dNTPs（2mM）5MgSO43Template1Primer R（10M）1Primer F（10M）1KOD

11、-plus-neo Polymease1Total50AB*延伸時間計算： ，向上取整數(shù)（多預留延伸時間）) s30/bp1000(值)bp引物片段大小(擴增速度* 退火溫度計算：一般為上下游引物TM平均值5Attention試劑如不完全融化，會造成濃度不均，酶需冰上放置PCR管根據(jù)目的基因名稱、日期、編號做標記模板(Template)可根據(jù)濃度確定加入體積，緩沖液(Buffer)必須在酶之前加入。注意不同引物對應不同PCR管PCR 結(jié)果優(yōu)化略，詳見pCR常見問題解決方法引物設計回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序pCR瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，本身不帶電荷。具有分子篩效應(凝膠色

12、譜)與電泳效應。目的：分離不同大小的核酸，以達到純化、鑒定的目的。原理：DNA分子遷移率與其大小成反比，電泳時 根據(jù)分子大小不同形成不同的條帶根據(jù)目的基因片段大小，配制不同濃度的凝膠引物設計pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化凝膠濃度目的基因片段(bp)0.5%1000-300000.7%800-120001.0%500-100001.2%400-70001.5%200-30002.0%50-2000引物設計pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化Attention瓊脂糖凝膠可根據(jù)情況分成數(shù)小塊（一般是每8孔），或插入孔徑不同的梳子EB具有強致癌性，應在污染區(qū)操作為保持凝膠成像儀與點樣

13、順序一致，點樣時應從右往左點（靠近自己一段開始）Marker是已知大小的正對照DNA，電泳能分離出不同條帶，相當于尺子上的刻度，可以用來測算未知DNA樣品的大小。紅色為正極，黑色黑色為負極，DNA 樣品由負極往正極泳動（靠近加樣孔的一端為負)。引物設計pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp E E Cap Cap Cap Cap 2B 2B 2A 2A NS1 NS1引物設計pCR雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序回收純化Procedure打開紫外燈，在操作臺上根據(jù)熒光位置切膠，動作要快并盡可能切小塊，切出的凝膠轉(zhuǎn)移至1.5ml E

14、p 管里，稱量凝膠重量 *凝膠成像儀的紫外燈對DNA有突變作用，應盡可能減少紫外燈對凝膠的照射按照E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit(200)試劑盒說明書回收純化DNA：Objective原理：限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段特定的DNA序列的特異位點上,并切割雙鏈DNA目的DNA與質(zhì)粒載體同時進行雙酶切（兩個不同的酶切位點，如BamH1和EcoR1），形成同樣的酶切位點為進行連接引物設計pCR回收純化連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序雙酶切Procedure目的DNA酶切體系試劑用量目的DNA41lBuffer（10）5lenzyme 12lenzyme 22ldd H2O 補至50

15、l載體酶切體系試劑用量Plasmid4g(X l*)Buffer（10）5lenzyme 12lenzyme 22ldd H2O 補至50l*根據(jù)質(zhì)粒濃度（如pcDNA3.1+3flag濃度為455ng/l，4000bp，反應體積約為9l）混勻，37孵育4-6h（6h以上更佳）Objective通過凝膠電泳驗證目的DNA、質(zhì)粒是否酶切成功，并通過膠回收DNA及質(zhì)粒（切去的片段除外）最終回收體積為30l通過連接使目的DNA導入質(zhì)粒中，為下一步轉(zhuǎn)染準備引物設計pCR回收純化雙酶切轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序連接Procedure目的DNA與質(zhì)粒連接體系試劑用量目的 DNA13-15lplasmid2-4l1

16、0 Ligase Buffer2lT4 DNA Ligase1lTotal20l混勻，4過夜或常溫條件下反應4h引物設計pCR回收純化雙酶切連接挑菌提質(zhì)粒測序轉(zhuǎn)化Objective將連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到感受態(tài)大腸桿菌中，從而使連接產(chǎn)物（重組質(zhì)粒）在大腸桿菌中大量復制LB培養(yǎng)基配制胰蛋白胨（Tryptone）10g/L酵母提取物（Yeast extract）5g/L氯化鈉（NaCl）10g/L瓊脂粉（Agar）*10-15g/L*配制固體LB時加入 每錐形瓶加入200/250ml（定量）引物設計pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒測序挑菌Objective從大腸桿菌培養(yǎng)基中挑取優(yōu)勢菌落（單菌落）

17、進行擴大培養(yǎng)培養(yǎng)過夜后取出部分菌液進行保菌Procedure消毒實驗臺及器具，取酒精棉球擦拭桌面、鑷子，準備無菌槍頭、試管、試管板兩個，點燃酒精燈，酒精消毒雙手取LB培養(yǎng)液加入抗生素，向各試管中倒入LB培養(yǎng)液約10-15ml從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，在火源附近打開，用鑷子夾取一個槍頭，挑取一個單菌落，輕輕沾取菌落，槍頭丟入試管內(nèi)，每菌種挑取2-3管培養(yǎng)皿用封口膜封好放入4保存將試管放入搖床震蕩培養(yǎng)過夜，次日出現(xiàn)渾濁消毒桌面，取1.5ml無菌Ep管標記搖勻試管，使底部菌落分散，吸取1000l菌液，加入200l 60%甘油， -20裝袋保存引物設計pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒測序挑菌Object

18、ive從宿主細胞大腸桿菌中提取大量復制后的質(zhì)粒引物設計pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌測序提質(zhì)粒Procedure按照E.Z.N.ATM Endo-free Plasmid Mini Kit (200)試劑盒說明書提取質(zhì)粒引物設計pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌測序質(zhì)粒濃度檢測器l 260/280比值（約1.8）l 260/230比值（約2.1）l 濃度400（ng/l）提質(zhì)粒Objective雙酶切方法使鑒定重組質(zhì)粒是否成功連接，凝膠電泳下觀察條帶（質(zhì)粒、目的DNA）引物設計pCR回收純化雙酶切連接轉(zhuǎn)化挑菌提質(zhì)粒測序Procedure酶切驗證體系試劑用量Plasmid1g(X l*)Buffer（10）2lenzyme 11lenzyme 21ldd H2O 補至20l1.混勻，4過夜或常溫條件下反應4h2.37水浴反應1-2h3.獲得的酶切產(chǎn)物加入2l Loading Buffer ，取10l進行瓊脂糖凝膠電泳（小孔）Attention1.填寫送樣登記表，樣品資料（樣品名稱、類型、抗性、載體名稱、長度）2.用PCR管