1、實驗四 細菌的分離培養及培養性狀的觀察在細菌學檢驗中，細菌的分離培養是重要的基本技術之一。從混雜微生物中獲得單一菌株純培養的方法稱為分離；純培養是指一株菌種或一個培養物中所有的細菌都是由一個細胞分裂、繁殖而產生的后代。分離培養的目的在于從被檢材料中，或者從污染的眾多雜菌中分離出純的病原菌。細菌分離培養應先從被檢材料或病料中分離培養單個菌落，然后釣取可疑菌落進行純培養，再將純培養物移植培養。 目的要求 1學習、掌握需氧菌和厭氧菌分離培養的基本要領和技術。 2了解細菌的菌落形態及其在各種培養基上的培養性狀。 3了解培養性狀對細菌鑒別的重要意義。 4掌握釣菌、純培養及移植技術。操作步驟一需氧性細菌分

2、離培養法1. 平板劃線分離法 菌種被其他雜菌污染時或混合菌懸液常用平板劃線法進行純種分離，此法是借助將蘸有混合菌懸液的接種環在平板表面多方向連續劃線，使混雜的微生物細胞在平板表面分散，經培養得到分散的由單個微生物細胞繁殖而成的菌落，從而達到純化目的。 但劃線分離的培養基必須事先傾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；為便于劃線，一般培養基不宜太薄，每皿約傾倒20 ml培養基，培養基應厚薄均勻，平板表面光滑。劃線分離主要有連續劃線法（圖4-1）和分區劃線法（圖4-2）兩種。劃線法示意圖見圖4-3。（1）連續劃線法圖4-3 劃線分離示意圖 圖4-1連續劃線法 圖4-2分區劃線法以無菌操作用接種環直

3、接取平板上待分離純化的菌落。將菌種點種在平板邊緣一處，取出接種環，燒去多余菌體。將接種環再次通過稍打開皿蓋的縫隙伸入平板，在平板邊緣空白處接觸一下使接種環冷卻，然后從接種細菌的部位在平板上自左向右輕輕劃線，劃線時平板面與接種環面成3040度角，以手腕力量在平板表面輕巧滑動劃線，接種環不要嵌入培養基內劃破培養基，線條要平行密集，充分利用平板表面積，注意勿使前后兩條線重疊。劃線完畢，關上皿蓋。灼燒接種環，待冷卻后放置接種架上。培 養皿倒置于適宜的恒溫箱內培養。培養后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態，涂片鏡檢為純種后再接種斜面。(2)分區劃線法（四分區劃線法）取菌、接種、培養方法與“連續劃線法

4、”相似。分區劃線法劃線分離時平板分4個區，故又稱四分區劃線法。其中第4區是單菌落的主要分布區，故其劃線面積應最大。為防止第4區內劃線與1、2、3區線條相接觸，應使4區線條與1區線條相平行，這樣區與區間線條夾角最好保持120度左右。先將接種環蘸取少量菌在平板上1區劃3-5條平行線，取出接種環，左手關上皿蓋，將平板轉動6070度。灼燒接種環，待在平板邊緣上冷卻后，再按以上方法以1區劃線的菌體為菌源，由1區向2區作第2次平行劃線。第2次劃線完畢，同時再把平皿轉動約6070度，同樣依次在3、4區劃線。劃線完畢，灼燒接種環，關上皿蓋，倒置于37恒溫箱中培養24h后，在劃線區觀察單菌落。2. 傾注平皿分離

5、法 被檢材料若含有兩種或兩種以上細菌時,可借助溶化的瓊脂將細菌稀釋，待瓊脂冷凝后,分散的細菌就被固定在原地形成菌落.這樣也能達到分得純種的目的。根據材料中存在菌數的多少，傾注平皿前可將被檢材料不稀釋或用生理鹽水作適當稀釋。其具體方法如下：取三支預先準備的普通瓊脂培養基試管，水浴加熱融化，冷至約50，用火焰滅菌接種環釣取待分離物接種至第一管內，充分搖勻后，自第一管取一接種環內容物至第二管，以同樣方法自第二管移種至第三管。然后分別傾注一個已滅菌的平皿，凝固后倒轉置于37溫箱內培養24h。結果多數細菌在瓊脂內生長成菌落，僅少數菌落出現在表面，通常第一個平板內的菌落數較多而密集，第二、三個平板則逐漸減

6、少，可見單個菌落。3. 芽胞需氧菌分離培養法 如果被檢材料中可疑有帶芽孢的細菌，可先將被檢材料加少量生理鹽水或肉湯，置于80水浴箱中維持1520分鐘，或85加熱10分鐘，再進行培養。材料中若有帶芽孢的細菌仍可存活而生長繁殖，不耐熱的細菌繁殖體則被殺滅。4利用化學藥品的分離培養法（1）抑菌作用 有些藥品對某些細菌有極強的抑制作用，而對另外一些細菌沒有抑制作用，所以可利用這種特性進行細菌的分離，例如通常在培養基中加入結晶紫或青霉素等化學藥品來抑制革蘭氏陽性菌的生長，以分離得到革蘭氏陰性菌。（2）殺菌作用 將病料如結核病料用15硫酸溶液處理，其他雜菌均被殺死，而結核桿菌因具有抗酸性而存活。（3）鑒別

7、作用 利用細菌對某種糖的分解能力，通過培養基中指示劑的變化來鑒別某種細菌。例如遠藤氏培養基可以用來鑒別大腸桿菌與沙門氏桿菌。5. 實驗動物分離法被檢病料中疑有某種病原菌存在，可將病料以無菌操作取出，放入滅菌乳缽或組織勻漿器內，加35倍量無菌生理鹽水制成混懸液，吸取一定量混懸液注射（肌肉、腹腔、皮下或靜脈）入易感實驗動物,待實驗動物死后，取其臟器，常可分離到純的病原菌。例如，疑有豬丹毒桿菌存在的病料，可注射于鴿體，鴿死后，再取其脾臟以分離豬丹毒桿菌，可得到純培養。6. 瓊脂斜面分離法 取瓊脂斜面3管，用接種環蘸取欲檢病料少許（如為臟器，先將表面燒烙后，用滅菌解剖刀切開，以滅菌接種環由切口插入、轉

8、動、釣取組織），混合于第1管的凝集水中，再作斜面劃線；然后抽出接種環，不經燒灼，繼續在第2管、第3管斜面上作同樣劃線。劃畢，置37溫箱中培養。經此法分離培養后，第2管的菌落較第1管為少，第3管的菌落更少，如此較易得到單個菌落，達到純培養之目的。7. 瓊脂平板涂布分離法 被檢病料如血液、腹水等，可用滅菌毛細吸管或吸管吸取 12滴置于平板中央，用滅菌的L形玻棒作均勻涂布。如估計細菌數很多，可直接用火焰滅菌的接種環釣菌，并做分區劃線。如為臟器病料，可先作成乳懸液再行涂布；或取其一小塊，用鑷子夾住，表面燒烙后，用滅菌刀切開，以其切面直接進行涂布，此法適用于含菌量較少的病料的分離。8. 營養肉湯分離法

9、當組織病料中含病原菌少，或有抗菌藥殘留時，用上述瓊脂斜面或平板分離法可能無菌落長出，這時可以無菌操作剪取一小塊病料直接投入肉湯，經37培養，在肉湯中長出細菌后，再用瓊脂斜面或瓊脂平板分離。二、厭氧性細菌分離培養法細菌接種后，直接放在恒溫箱內培養，可以使需氧菌與兼性厭氧菌生長繁殖；但對厭氧菌，則需將培養環境或培養基中的氧氣除去，或將氧化型物質還原，降低其氧化還原電勢，才能生長繁殖。在有氧的環境下，培養基的氧化還原電勢較高，不適于厭氧菌的生長。為使培養基降低電勢，降低培養環境的氧分壓是十分必要的。現有的厭氧培養法很多，主要有生物學法、化學法和物理學法，可根據各實驗室的具體情況而選用。（一）生物學方

10、法 培養基中含有植物組織（馬鈴薯、燕麥、發芽谷物等）或動物組織（新鮮動物組織小片，或加熱的肌肉、心腦等），因組織的呼吸作用，以及組織中可氧化物質的氧化而消耗氧氣（肌肉、腦磷脂中不飽和脂肪酸的氧化，碎肉培養基的應用），造成厭氧環境，以利于厭氧性細菌的生長繁殖。同時，組織中所含的還原性化合物（谷胱甘肽）也可使氧化-還原電勢下降。此外，將厭氧菌與需氧菌共同培養在同一環境中，則環境中的氧被需氧菌消耗，造成厭氧環境，也有利于厭氧菌的生長繁殖。1. 動物組織及其他物質加入法 在液體培養基內加入肝臟、腎臟等動物臟器，因其中的半胱氨酸的一SH基極不穩定，為強還原劑，所以可利用此培養基進行厭氧培養，在培養之前將

11、肝片肉湯加熱，以驅出空氣，冷卻，然后接種培養。2. 共棲培養法 將厭氧菌與需氧菌共同培養在同一個平皿內，利用需氧菌的生長繁殖將氧氣消耗后，造成厭氧環境利于厭氧菌生長。其具體方法是將培養皿的一半接種消耗氧氣能力極強的需氧菌如靈桿菌、大腸桿菌、枯草桿菌等。另一半接種厭氧菌， 接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37恒溫箱中培養23d， 即可觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長。（二）化學方法 利用還原能力強的化學物質，將環境或培養基內的氧氣消耗，或還原氧化型物質，降低氧化-還原電勢。1. 焦性沒食子酸法 焦性沒食子酸在堿性溶液內能大量地吸收氧而造成厭氧環境，有利于厭氧菌的生長繁殖。通常100

12、cm3空間用焦性沒食子酸1g及10氫氧化鈉或氫氧化鉀10m1。具體方法有下列幾種：（1）平板培養法 將厭氧菌劃線接種于適宜的瓊脂平板，取一小團直徑約2cm的脫脂棉，置于平皿蓋的內面中央，其上滴加0.5ml 10氫氧化鈉溶液；在靠近脫脂棉的一側放置0.5g焦性沒食子酸，暫勿使兩者接觸。立即將已接種的平板覆蓋于平皿蓋上，迅速用融化的石蠟密封平皿四周。封畢，輕輕搖動平皿，使被氫氧化鈉溶液浸濕的脫脂棉與焦性沒食子酸接觸，然后置37恒溫箱中培養2448h后，取出觀察。 圖4-4 Buchner氏厭氧培養法 圖4-5 瑞氏厭氧培養法（2）Buchner氏試管法（圖4-4） 取一大試管，在管底放焦性沒食子酸

13、0.5g及玻璃珠數個或放一螺旋狀鉛絲。將已接種的培養管放入大試管中，迅速加入2NaOH溶液0.5ml，立即將試管口用橡皮塞塞緊，必要時周圍用石蠟密封。37培養2448h后觀察。（3）瑞氏厭氧培養法（圖4-5） 將已接種細菌的培養管的脫脂棉棉塞在火焰中灼燒滅菌后，塞入管中離培養基11.5cm處，置適量焦性沒食子酸于其上，加入10%NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞將管口塞緊，以膠泥或石蠟嚴密封閉置溫箱中培養。（4）史氏厭氧培養法 用圖4-6所示的厭氧培養皿，在皿底一邊置焦性沒食子酸，另一邊置NaOH溶液，將已接種的平皿翻蓋于皿上，并將接合處用膠泥或石蠟密封，然后搖動底部，使氫氧化鈉與焦性沒食子酸混

14、合，置溫箱中培養。（5）平皿厭氧培養法 置一片中有小圓孔的金屬板于兩平皿之間，上面的平皿接種細菌，下面的平皿盛焦性沒食子酸及氫氧化鈉溶液，用膠泥封閉后置溫箱中培養（圖4-7） 圖4-6 史氏厭氧培養法 圖4-7 平皿厭氧培養法（6）玻罐或干燥器法 置適量焦性沒食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，將培養皿或試管置于隔板上，并在玻罐內置美蘭指示劑一管，從罐側加入氫氧化鈉溶液于罐底，將焦性沒食子酸用紙或紗布包好，用線系住，暫勿與氫氧化鈉接觸，等一切準備好后，將線放下，使焦性沒食子酸落入氫氧化鈉溶液中，立即將蓋蓋好，密封，置溫箱中培養。 2. 李伏夫（）氏法 此法是利用連二亞硫酸鈉（Sodium hye

15、rosulphite）和碳 酸鈉以吸收空氣中的氧氣,釋放二氧化碳造成厭氧環境。其反應式如下：Na2S2O4+Na2CO3+O2Na2SO4+Na2SO3+CO2取一有蓋的玻璃罐，罐底墊一薄層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內（如是液體培養基，則直立于罐內），最上端保留可容納12個平皿的空間（視玻罐的體積而定），按玻罐的體積每1000cm3空間用連二亞硫酸鈉及碳酸鈉各30g，在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少許使混合物潮濕，但不可過濕，以免罐內水分過多。若用無蓋玻罐，可將平皿重疊正放在淺底容器上，以無蓋玻罐置于皿上，罐口周圍用膠泥或水銀封閉,如圖4-8所示。3. 硫乙醇酸鈉法 硫乙醇酸鈉是

16、一種還原劑，加入培養基中，能除去其中的氧或還原氧化型物質，促使厭氧菌生長。其它可用的還原劑包括葡萄糖、維生素C及半胱氨酸等。（1）液體培養基法 將細菌接入含0.1%的硫乙醇酸鈉液體培養基中，并加入美蘭溶液作為氧化還原的指示劑，37培養2448h后觀察，在無氧條件下，美蘭被還原成無色。 圖4-8 李伏夫氏厭氧培養法 圖4-9 Brewer氏培養皿 圖4-10 Mc1gtoshFildes二氏厭氧罐（2）固體培養基法 利用特殊構造的Brewer氏培養皿，可使厭氧菌在培養基表面生長而形成孤立的菌落。具體方法如下：先將Brewer氏培養皿干熱滅菌，將溶化冷卻至50左右的硫乙醇酸鈉固體培養基傾入皿內。待

17、瓊脂冷凝后，將厭氧菌接種于培養基的中央部分。蓋上皿蓋，使皿蓋內緣與培養基外圍部分相互緊密接觸（圖4-9）。此時皿蓋與培養基中央部分留在空隙間的氧氣被硫乙醇酸鈉還原，美蘭指示劑逐漸褪色，而外緣部分，因與大氣相通，仍呈藍色。將Brewer氏培養皿于37恒溫箱內2448h后觀察。（三） 物理學方法 利用加熱、密封、抽氣等物理方法，以驅除或隔絕環境及培養基中的氧氣，造成厭氧環境，有利于厭氧菌的生長繁殖。1. 厭氧罐法 常用的厭氧罐有Brewer氏罐、Brown氏罐和Mc1gtoshFildes二氏罐（圖4-10）。將接種好的厭氧菌培養皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣至大氣壓。通電，使罐中殘

18、存的氧與氫經受鉑或鈀的催化而化合成水，使罐內氧氣全部消失。將整個厭氧罐放入溫箱培養。2. 真空干燥器法 將接種好的平皿或試管放入真空干燥器中，開動抽氣機，抽至高度真空后，替代以氫、氮或二氧化碳氣體。將整個干燥器放進孵育箱中培養。3. 加熱密封法 將液體培養基放在阿諾氏鍋內加熱10min，驅除溶解液體中的空氣，取出，迅速置于冷水中冷卻。接種厭氧菌后，在培養基液面覆蓋一層0.5cm的無菌凡士林石蠟。置37培養2448h后觀察。4. 高層瓊脂柱法 加熱融化一管適合分離厭氧菌用的瓊脂培養基，待冷至50左右，接入少許經適當稀釋的待分離的培養物或含菌材料，充分搖震均勻。在瓊脂凝固前，迅速以無菌滴管吸取上述

19、已接種的瓊脂培養基，注入準備好的玻璃管內（長約15 cm，一端塞小膠塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高壓滅菌備用），裝至45左右之處，塞好棉花塞，放在大試管或玻璃筒內，置37恒溫箱中培養。長出菌落后，拔去膠塞和棉花塞，以無菌玻棒將瓊脂柱推出于無菌平皿中，再用滅菌接種環釣取獨立菌落作厭氧純培養。三、兼性厭氧菌的分離培養方法(二氧化碳培養法) 在細菌培養中，有少數細菌（如牛型布氏桿菌）在含有510二氧化碳的環境下才能生長。最簡單的二氧化碳培養法是燭缸法：將接種細菌的培養基置玻璃干燥器或其他可以密閉的玻璃缸內，在其內點燃一小段蠟燭，加上蓋（蓋邊涂上凡士林以防漏氣），約1min左右蠟燭自然熄滅，此時缸內氧

20、氣已被消耗，缸內所含二氧化碳約510。注意蠟燭勿太長，而且不宜靠近缸壁，以免因局部玻璃過熱而破裂。也可用化學物質作用生成二氧化碳氣體如碳酸氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸。四、細菌的釣菌、純培養和移植 圖4-11 斜面接種時試管的拿法將劃線分離培養3724h的平板從溫箱中取出，挑取單個菌落，經涂片、染色鏡檢，證明不含雜菌，此時用接種環挑取單個菌落，移植于瓊脂斜面培養，所得培養物即為純培養物，再作其它各項試驗檢查和致病性試驗等。具體操作方法如下： 1. 接種環移植法 兩試管斜面移植時，左手斜持菌種管和新鮮空白瓊脂斜面各一管，使管口互相并齊，稍上斜，管底握于手中，松動兩管棉塞，以便接種時容易拔出（圖4

21、-11）。右手食指和拇指執接種環，燒灼接種環，以右手小指扭開一管的棉塞，無名指扭開第二管的棉塞。棉塞頭向掌心內，將試管口通過酒精燈火焰滅菌，待冷卻后將接種環插入菌種管中，釣取細菌少許取出接種環立即接種在新鮮空白瓊脂斜面上，不要碰及管壁，直達斜面底部。從斜面底部開始劃曲線或直線，向上至斜面頂端為止，管口通過火焰滅菌后，塞好棉塞。接種完畢，將接種環燒灼滅菌后放下接種環。用蠟筆在試管上標明細菌名稱和接種日期，置37溫箱中培養。斜面接種無菌操作過程如圖4-12所示。圖4-12 斜面接種無菌操作程序2. 吸管或注射器移植法 欲移植定量的液體培養物或表面有液體石蠟油的厭氧菌培養物，可以利用吸管或注射器移植

22、，其操作方法是以無菌吸管或無菌注射器吸取培養物，代替接種環進行移植。五、穿刺培養明膠穿刺和瓊脂柱穿刺方法基本上與純培養接種相同，不同的是用接種針挑取菌落，垂直刺入培養基中。要從培養基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。六、細菌培養性狀的檢查（一）細菌在固體培養基上的生長表現1. 瓊脂平皿上的生長表現 細菌于固體培養基表面生長繁殖，形成單個肉眼可見的細菌集落群體，稱為菌落。各種細菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鑒別某種細菌。如葡萄球菌在瓊脂平皿上，由于產生色素的不同，形成各種顏色的圓形而突起的菌落；炭疽桿菌形成扁平干燥，邊緣不整齊的火焰狀菌落，用放大鏡觀察時，呈卷發樣構造；腸

23、道桿菌屬的細菌，形成圓形、濕潤、粘稠、扁平、大小不等的菌落；巴氏桿菌和豬丹毒桿菌，形成細小露珠狀菌落。觀察菌落的方法除肉眼外，還可用放大鏡，必要時也可用低倍顯微鏡進行檢查。觀察的主要內容有（圖4-13，圖4-14）：1 2 3 4 5 6 7 8圖4-13 菌落的形狀、邊緣和表面構造1 圓形、邊緣整齊、表面光滑；2圓形、邊緣整齊、表面有同心圓；3圓形、葉狀邊緣、表面有放射狀皺褶；4圓形、鋸齒狀邊緣、表面較不光滑；5不規則形、波浪狀邊緣、表面有不規則皺紋；6圓形、邊緣殘缺不全、表面呈顆粒狀；7毛狀 ；8根狀1 2 3 4 5 6 7 8圖4-14 菌落的隆起度1扁平狀； 2低隆起；3隆起；4臺狀； 5臍狀；6紐扣狀；7乳頭狀；8褶皺凸面（1）大小 菌落的大小，規定用毫米（mm）表示，一般不足lmm者為露滴狀菌落； 12mm者為小菌落；24mm者為中等大菌落；46mm或更大者稱為大菌落或巨大菌落。（2）形狀 菌落的外形有圓形、不規則形、根足形、葡萄葉形。（3）邊緣 菌落邊緣有整齊、鋸齒狀、網狀、樹葉狀、蟲蝕狀、放射狀等。（4）表面性狀 觀察其是否平滑、粗糙、皺襞狀、旋渦狀、荷包蛋狀，甚至有子菌落等。（5）隆起度 表面有隆起、輕度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤狀者。（6）顏色及透明度 菌落有無色、灰白色，有的能產生各種色素；菌落是否有光澤，其透明度可分為透明、半透明及不透明。（7）硬度