1、ELISA 原理與分類1. ELISA 的原理 ELISA 的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性， 又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很

2、高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。2. ELISA 的類型 ELISA 可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1） 固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2） 酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3） 酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的 ELISA 主要有以下幾種類型：2.2.1體夾心法測抗原體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：1） 將特異性抗體與固相載體聯結

3、，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要獲得受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的

4、動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見 1.3.2，圖 1-4），如按測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達后呈鉤狀彎落。鉤狀效

5、應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中 HBsAg、AFP 和尿液 hCG 等）時，應注意可測范圍的最高值。用和力的單克隆抗體此類試劑可削弱鉤狀效應。 假使在被測的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如 HBsAg 的 a 決定簇，也可用此決定的同一單抗分別包被固相和酶結合物。但在 HBsAg 的檢測中應注意亞型問題，HBsAg 有 adr、adw、ayr、ayw4 個亞型，雖然每種亞型均有相同的 a 決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。體夾心法測抗原的另一是類風濕因子（RF）的干擾。RF 是一種自身抗體，多為 IgM

6、型，能和多種動物 IgG 的 Fc 段結合。用作體夾心法檢測的血清標本中如含有 RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。采用 F（ab'）或 Fab片段作酶結合物的試劑，由于去除了 Fc 段，從而消除 RF 的干擾。體夾心法 ELISA 試劑是否受 RF 的影響，已被列為這類試劑的一項指標（參見 6.2）。體夾心法適用于測定二價或二價以上的大抗原，但不適用于測定半抗原及小成兩位點夾心。單價抗其不能形2.2.2原夾心法測抗體 反應模式與體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中

7、受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。標志物中抗 HBs 的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的適的標記方法。，應根據抗原結構的不同，尋找合2.2.3 間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖 2-3）。操作步驟如下：1） 將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。2） 加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標抗抗體。

8、可用酶標抗人 Ig 以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人 IgG 檢測 IgG 抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。4）加底物顯色 本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。 間接法的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以 E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有 E.Coli 成份，很可能與受過 E.Coli者血

9、甭中的抗E.Coli 抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人 Ig 反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的 Ig 去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。 間接法中另一種干擾因正常血清中所含的高濃度的非特異人血清中受檢的特異性 IgG 只占總 IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很強，非特異 IgG 可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本稀釋（1:401:200），以避免過高

10、的本底影響結果的。2.2.4 競爭法測抗體 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體，因此陽性反應呈色淺于反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗 HBcELISA 一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進

11、行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗 HBe 的檢測一般采用此法。2.2.5 競爭法測抗原 小抗原或半抗缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能抗體夾心法進定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原，最后的顯色也愈淺。小激素、等 ELISA 測定多用此法。2.2.6 捕獲包被法測抗體 IgM 抗體的檢測用于傳染病的早期中。間接法 ELISA 一般僅適用于檢測總抗體或 IgG 抗體。如用抗原包被的間接法直接測定 IgM 抗體，因標本中一般同時較高濃度的 IgG 抗體，后者將競爭結合固相抗

12、原而使一部份 IgM 抗體不能結合到固相上。因此如用抗人 IgM 作為二抗，間接測定 IgM 抗體，必須先將標本用 A 蛋白或抗 IgG 抗體處理，以除去 IgG 的干擾。在臨床檢驗中測定抗體 IgM 時多采用捕獲包被法。先用抗人 IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的 IgM（其中包括抗原的特異性 IgM 抗體和非特異性的 IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性 IgM 相結合。繼而加酶標記抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的 IgM 成正相關。此法常用于抗原的特異性染的早期。甲型肝炎（HAV）抗體的檢測模式見圖 2-7。 類風濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測定 IgM 抗體，導致假陽

13、性反應。因此中和 IgG 的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM 和抗弓形蟲 IgM 抗體已獲。2.2.7 ABS-ELISA 法 ABS素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和一種糖蛋白， 化合物，種類型的大小量 60000，每個由 4 個能和生物素結合的組成。生物小量 244。用化學方成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質和糖等多形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由于一個親和素可與 4 個生物素結合，因此如把 ABS 與 ELISA 法可分為酶標記親和

14、素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA 系統中的酶標抗體（抗原）。在 LAB 中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然后再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和蛋清中提取，這種卵親和堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于 ELISA 中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和無此缺點，在 ELISA 應用中有替代前者的趨勢。由于 ABS-ELISA 較普通 ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中 ABS-ELISA 應用不多。ELISA 技術中的抗原與抗體的反應抗體1.2.1 抗體的結構

15、抗體是能與抗原特異性結合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig 分五類，即 IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE。與免疫測定有關的 Ig 主要為 IgG 和 IgM。Ig 由兩個輕鏈（L）和兩個重鏈（H）的單體組成。Ig 的輕鏈是相同的，有（kappa）和（Lambda） 兩種型別。五類 Ig 的重鏈結構不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG 和 IgM 的重鏈分別稱為（gamma）鏈和（mu）鏈。IgG 的結構見圖。 木瓜酶裂解部位 胃蛋白酶裂解部位 重鏈和輕鏈的 N 端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區，分別用 VH和 VL 表示。兩者抗體的抗原結合部位，

16、只與相應的抗原決定簇匹配，發生特異性結合（見圖），是抗體專一性結合抗原的結構基礎。 IgG 可被木瓜蛋白酶分解為三個區段，其中兩個相同的區段稱抗原結合片段（Fab）。每個 Fab 都保存結合抗原的能力，但只有一個抗原結合位點，是單價的，與抗原結合后不出現凝集或沉淀。另一區段稱 Fc 段，無抗體活性，但具有 IgG 特有的抗原性。 IgG 可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個 Fab 雙體，稱 F（ab'）2，能和兩個相同的抗原結合；另一片段類似 Fc，隨后被分解成小多肽，無生物活性。 IgM 是由五個單體組成的五聚體，含 10 個重鏈和 10 個輕鏈，具有 10 個抗原結合價，由于空間位置

17、的影響，只表現為五個抗原結合價。IgM量約為 900000，IgG量約為 150000。 機體被微生物后，先產生 IgM 抗體，然后產生 IgG 抗體。經過一段時間，IgM 抗體量逐漸減少而消失，而 IgG 抗體可長期，在疾病痊愈后可持續數年之久。 IgM抗體一般為保護性抗體具有免疫性。因此 IgM 抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床價值。右圖為為甲型肝炎血清中 IgG 抗體和 IgM 抗體出現的時間和水平。1.3 抗原抗體反應1.3.1 可逆性 抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態平衡，其反應式為：Ag+AbAgAb 抗體的親和力（affi）是抗原抗體間的固有結合力，

18、可以用平衡常數 K表示： K=AgAbAgAb AgAb 的解離程度與 K 值有關。和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG 抗體僅占總 IgG 中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱應用于免疫測定中可得到更好的效果。層析純抗體，1.3.2 最適比例 在恒定量的抗體中加入遞增量的抗成抗體復合物（沉淀）的量見圖1-4。曲線的部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價帶（zone of equivalence）。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過

19、剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成， 在免疫測定中稱為帶現象（zone phenomenon）。抗體過量稱為前帶（prezone），抗原地過量稱為后帶（postzone）。在用免疫學方法測定抗原時，應使反應系統中有足夠的抗體量，否則測得的量會小于實際含量，甚至出現假。1.3.3 特異性 抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結合位點之間。由于兩者在化學結構和空間構型上呈互補關系，所以抗原抗體反應具有高度的特異性。例如同一中的表面抗原（HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和抗體（HBcAg），隨來源于，但僅與其相應的抗體結合，而不與另外兩種抗體反應。抗原抗體反應的這種

20、特異性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合物（例如血清）中測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。 但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分相同的結構，在抗原抗體反應中可出現交叉反應。例如：絨毛膜促激素（hCG）和生成激素（LH）均由和兩個亞組成，其結構的不同處在亞，而兩者的亞是同類的。用hCG 免疫動物所得的抗血清中含有抗-hCG 和抗-hCG 兩種抗體，抗-hCG 抗體將與 LH中的 酶位發生交叉反應。在臨床檢驗中，如用抗 hCG 抗血清作為妊娠試劑檢定尿液中 hCG，只能用于 hCG 濃度較高的試驗，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量 LH 將與之發生交叉反應。因此在作為早孕敏感

21、度應達到 50mIu/mlhCG）的實際中必須應用只對 hCG特異的抗-hCG，以避免與其它激素的交叉反應的發生。1.3.4 敏感性 在測定血清中某一物質的含量時，化學比色法的敏感度為 mg/ml 水平，酶反應測定法的敏感度約為 510g/ml，免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應法相仿。標記的免疫測定的敏感度可提高數千倍，達 ng/ml 水平。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定 HBsAg，其敏感度可達 0.1ng/ml。1.4 免疫測定在臨床檢驗中的應用 由于各種抗原成份，包括小的半抗原，均可用以特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標本中相應的抗免疫測定的應

22、用范圍極廣，在臨床檢驗中可用于測定：此1)2)3)4)5)體液中的各種蛋白質，包括含量極少的蛋白質如甲胎蛋白等。激素，包括小量的甾體激素等。抗生素和。病原體抗原，HBsAg、HBeAg 等。另外，也可利用純化的抗原檢測標本中的抗體，例如抗-HBs 等5 標記的免疫測定 如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反應后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達 510g/ml，但在臨床檢驗中，某些待測物在標本中的含量遠低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法。標記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質加以標記，通過測定標記物來提高敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標記物分別

23、為放射性核素和酶，最后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比直接測定沉淀物提高數百至數千倍。在標記免疫測定中，一般加入過量的標記試劑以保證與待測物徹底反應。以標記抗體（Ab）檢測抗原（Ag）為例，反應式如下：Ag+ Ab AgAb+ Ab 在反應產物中有與 Ag 結合的 Ab和游離和 Ab，如不將兩者分離而測定標記物，測得的結果將為兩者之和。因此，游離標記物與結合標記物的分離是標記免疫測定中的重要步驟。可采用多種，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標記的抗原或抗體直接反應，結合的標記物被固定在載體上，而游離的標記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的 Ab除

24、去，結合標記物的測定可在固相上進行。6 酶免疫測定 酶免疫測定（enzyme immunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。在均相 EIA 中可不需進行游離的和結合的標記物的分離而直接測定標記物。例如在某種條件下，抗原抗體反應后形成的酶標記抗原抗體復合物中的酶失去其對底物作用的活力，因而測出的酶活力直接反映游離的酶標記物。均相 EIA 在臨床檢驗中較少應用。非均相 EIA 需先進行游離的和結合的標記物的分離。如前所述，固相載體可用作一種分離。這種固相酶免疫測定方法在最初建立時稱為酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immun

25、osorbent assay），簡稱 ELISA，在國內有譯作酶聯免疫吸附試驗的，雖然含義全確切，但已習用。3.ELISA 樣本處理上清以及組織勻漿等。不同樣本類型的預處理方法也不同。適當的樣本預處理是確保 ELISA實驗正確性和準確性的第一步。這里，幾種不同樣本類型的處理方法。1.血清血清是 ELISA 實驗最常用的樣本，其預處理也十分簡單。使用無熱原無內毒素的試管或離心管血液樣本，將試管或離心管在室溫下放置 2 小時或4過夜，分離清（建議傾斜試管或離心管以擴大液面的橫截面，使血清可以更大程度地分離出來）。4下以 1000×g 離心 20 分鐘，收集上清液（血清），立即進定。建議在

26、-20或-80下將收集的血清分裝保存，避免反復凍融。在收集血液樣本的過程中應避免溶血，因為紅細胞在溶解時會具有過氧化物酶活性的物質，這種情況下，ELISA 實驗中將會出現非特異性顯色反應，導致檢測結果確，出現假陽性結果。另外，樣本還應避免細菌污染，因為細菌可能含有內源性 HRP，也會導致檢測結果確。2.血漿使用含抗凝劑的采或離心管血液樣本，后 30 分鐘內，4下以 1000×g 離心15 分鐘，收集上清液（血漿）。建議在-20或-80下將收集的血漿分裝保存，避免反復凍融。樣本應避免溶血或高血脂。常見的抗凝劑包括 EDTA，肝素鈉，枸櫞酸鈉等。檢測前請仔細閱讀 ELISA 試劑盒說明書

27、，查看該試劑盒抗凝劑是否有特殊要求。3.細胞培養上清將細胞培養上清液吸入離心管中并以 1000×g 離心 20 分鐘，除去細胞碎片和雜質，收集上清液備用，樣本保-20或-80，避免反復凍融。可用于 ELISA 實驗的樣本一般有血清、血漿、尿液、細胞培養4.細胞反復凍融方法1） 吸出培養板中的培養基，用胰蛋白酶消化細胞，然后加入適量的培養基將培養板上的細胞沖洗干凈。懸浮細胞可以省略該步驟。2） 將細胞懸浮液收集到離心管中，以 1000×g 離心 10 分鐘，然后吸去培養基，用預冷 PBS洗滌細胞 3 次。3） 加入適量的預冷 PBS（建議在使用前立即加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞

28、。在 6 孔培養板中，每個孔需要 150-250L 的 PBS 來重懸細胞。4） 使樣本在-20或-80條件和室溫條件下反復凍融，重復凍融過程數次，直至細胞完全裂解。也可以使用超聲波細胞破碎器超聲處理懸浮液來裂解細胞。5）4下以 10,000×g 離心 10 分鐘，去除細胞碎片，收集上清液， -20或-80保存，避免反復凍融。5.組織勻漿1）用預冷的 PBS（0.01M，PH7.4）沖洗組織以除去表面殘留的血液或雜質。2）將組織塊稱重，然后切成盡可能小的碎塊，以便充分勻漿。3）加入適量的預冷 PBS（體積取決于組織的重量，9 mLPBS 適用于 1 g 組織，建議使用前立即在 PBS

29、 中加入適量蛋白酶抑制劑），用勻漿器在冰上或冰浴中充分勻漿。4） 將勻漿液吸入離心管中，4 下以 5000×g 離心 510 分鐘，收集上清液，保存至-20或-80，避免反復凍融。6.尿液、唾液及其他生物體液以 1000×g 離心 20 分鐘，收集上清液，立即進定。一般來說，由于 ELISA 實驗只能檢測可溶性蛋白質的含量，因此要求樣本應清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質。為確保實驗的準確性， -20或-80保存的樣本應在1-6內完成檢測，4保存的樣本在一周內完成檢測。此外，樣本中不能含有會抑制 HRP活性的 NaN3，否則會造成假結果。4 ELISA 技術的-操作要點優質

30、的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA 的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內醫學檢驗一般均用板式點。本文將敘述板式ELISA 各個操作步驟的注意要點，珠式、管式及磁性球 ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應用，兩者均有詳細的使用說明，嚴格遵照規定操作，必能得出準確的結果。4.1 標本的采取和保存可用作 ELISA 測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進定（如血清、尿液），有些則需經預處理（如糞便和某些物）。大部分 ELISA 檢測均以血清為標本。血

31、漿中除尚含有蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外，在醫學檢驗中均以血清作為檢測標本。在 ELISA 中血漿和血清可同等應用。血清標本可按常規方法，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會出具有過氧化物酶活性的物質，以 HRP 為標記的 ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。 血清標本新鮮時檢測。細菌污染，菌體中可能含有內源性 HRP，也會產生假 陽性反應。如在冰箱中保存，其中的可發生聚合，在間接法 ELISA 中可使本底加深。一般說來，在 5 天內測定的血清標本可放置于 4，超過一周測定的需低溫冰存。凍

32、結血清宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉淀的血清標復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰 存。保存血清自適當防腐劑（見 3.2.4）。4.2 試劑的準備時就應注意無菌操作，也可加入按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用 pH 計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。4.3 加樣 在 E

33、LISA 中一般有 3 次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時所加物加在 LEISA 板孔的底部，避免加在標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。 加。每次加標本應更換吸嘴，以免發生交叉污染，也可用的定量管加樣。有此測定（如間接法 ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩 1 分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。4.4 保溫在 ELISA 中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有

34、一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為(incubation)，有人稱之為孵育，在 ELISA中似不恰當。 ELISA 屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有最貼近的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么 ELISA 反應總是需要一定時間的。采用的溫度有 43、37、室溫和 4度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。（冰箱溫度）等。37是中常用的保在建立 ELISA 方法作反應動力學研究時

35、，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在 37經 1-2小時，產物的生成可達頂峰。為反應，可提高反應的溫度，有些試驗在 43進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應 4更為徹底，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在 ELISA 中一般不予采用。 保溫的有的 ELISA 儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將 ELISA 板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA 板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后

36、將 ELISA 板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標準室度是指 20-25，但具體操作時可根據說明書的要求。室育時，ELISA 板只要平置于操作臺上即可。應注意的溫度和時間應按規定力求準確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。4.5 洗滌洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板沒能與固相抗原或抗體結

37、合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在 ELISA 操作中，洗滌是最主要的格按要求洗滌，不得馬虎。 洗滌的，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴某些 ELISA 儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過程如下： （1）浸泡式 a.吸干或甩干反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2 分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水

38、紙上拍干；e.重復操作 c 和d，洗滌 3-4 次（或按說明規定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。 微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫 20，其濃度可在 0.05%-0.2%之間，高于 0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。 （2）流水沖洗式 流水沖

39、洗法最初用于小珠載體的洗滌， 洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續沖洗 2 分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡 2 分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。4.6 顯色和比色4.6.1 顯色 顯色是 ELISA 中的最后一步反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，保持無色，而陽性隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于顯

40、色進行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照對照孔的顯況適當縮短或延長反應時間，及時。OPD 底物顯色一般在室外溫或 37反應 20-30 分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD 底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD 產物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。 TMB 受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性，規定的適當時間閱讀結果。TMB 經 HRP 作用后，約 40 分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減

41、弱，至 2 小時后即可完全消退至無色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使維持較長時間（12-24 小時）不褪，是目視的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使測讀吸光值。轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）4.6.2 比色比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準 96 孔的座架中，進行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。 比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（任何反應僅加底物液的空白生理鹽水或稀釋液蒸餾水

42、校零點，代替標本作全過程的孔），以本次試驗的試劑狀況。其后可用空白以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。 比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于 A 字母的右下角，如 OPD 的吸收波長為 492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。4.6.3 酶標比色儀酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指于測讀 ELISA 結果吸光度的光度計。固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶標

43、儀。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到 0.001，準確性為±1%，重復性達 0.5%。舉例說，若某孔測得的 A 值為 1.083，則該孔相對于空氣的真實 A 值應為 1.083±0.01(1.0731.093），重復測定數次，其 A 值均應 1.083±0.05（1.0781.088）在之間。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在 0.0002.000，新型號的酶標儀上限拓寬達 2.900，甚至更高。超出可測上限的 A 值常以"*"或"o

44、ver"或其它符號表示。應注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為 0.0002.900，而其線性范圍僅 0.0002.000，這在定量 ELISA 中制作標準曲線時應予注意。 酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫1530，使用前先預熱儀器 15-30 分鐘，測讀結果更穩定。 測讀 A 值時，要選用產物的敏感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波長。有的酶標儀可波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2）， 兩次測定間不移動 ELISA 板的位置。例如 OPD 用 492nm 為 W1，630nm

45、 為 W2，最終測得的 A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細4.7 結果4.7.1 定性測定說明書。定性測定的結果分別用"陽性"、"是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統中有反應。""則為無反應。用定性法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽

46、性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺為性、弱陽性更具定量意義。 在間接法和夾心法 ELSIA 中，陽性色深于孔。在競爭法 ELISA 中則相反色深于陽性孔。兩類反應的結果方法不同，分述。（1）間接法和夾心法 這類反應的定性結果可以用肉眼。目視標本也無色或近于無色者判為，顯色清晰者為陽性。但在 ELSIA 中，正常人血清反應后出現呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測對照。對照的組顯色深于下，應該用成應為不含受檢物的正常血清或類似物（見 3.6）。在用肉眼結果時，更對照作為標本陽性的指標。 目視法簡捷

47、明了，但頗具性。在條件比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數據。先讀出標本（sample，S）、陽性對照（P）、和對照（N）的吸光值，然后進行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標本與對照比值法兩類。 a 陽性判定值 陽性判定值（cut-off value）一般為對照 A 值加上一個特定的常數，以此作為結果陽性或的標準。 用此法結果要求實驗條件十分恒定，試劑的必須標準化，陽性和的對照品應符合一定的規格，須配用精密的儀器，并嚴格按規定操作。陽性判定值公式中的常數是在這特定的系統中通過對大量標本的實驗檢測而得到的。現舉某種檢測 HBsAg 的試劑盒為例。試劑盒中的對照品為不含 HBsAg

48、 的復鈣人血漿，陽性對照品 HBsAg 的含量標明為 P=9±2ng/ml。每次試驗設 2個陽性對照和 3 個對照。測得 A 值后，先計算對照 A 值的平均數（NCX）和陽性對照 A 值的平均數（PCX），兩個平均數的差（P-N）必須大于一個特定的數值（例 0.400），試驗才有效。3 個對照 A 值均應0.5×NCX，并1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個對照重新計算 NCX；兩個對照 A 值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算： 陽性判定值=NCX+0.05 標本 A 值陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為。應注意的是，式中

49、 0.05 為該試劑盒的常數，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。 根據以上敘述可以看出，在這種方法中對照和陽性對照也起到試驗的質控作用，試劑變質和操作不當均會產生"試驗無效"的后果。 b.標本/對照比值 在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種法較為合適。在得出標本（S）和對照（N）的 A 值后，計算 S/N 值。也有寫作 P/N 的，這里的 P 不代表陽性(positive)，而是（patient）的縮寫，不應誤解。為避免，更S/N 表示。在早期的間接法 ELISA 中，有些作者定出 S/N 為陽性標準，現多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統應該用

50、實驗求出各自的 S/N 的閾值。更應注意的是，N 所代表的對照是不含受檢物質的人血清。有的試劑盒中所設對照為不含蛋白質或蛋白質含量較底的緩沖液，以致反應后產生的本底可能較正常人血清的本底低得多。做 ELISA 試劑盒標準曲線樣品檢測時有幾個問題需要注意1、樣品的濃度等指標是根據標準曲線計算出來的，所以首先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事，否則后面的實驗結果無從談起。3、最好采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度，ELISA 試劑盒這樣就能夠保證標準樣品的濃度出現較大的偏離。4、檢測標準樣品時，應按濃度遞增順序進行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準確性。5、標準曲線的樣品數

51、一般為 7 個點，但至少要保證有 5 個點。6、做出的標準曲線相關系數因實驗要求不同而有所變動，但一般來說，相關系數 R 至少要大于 0.98，對于有些實驗，至少要 0.99 甚至是 0.999.二、選擇什么方程去擬合在 S 曲線的低濃度部門可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部門可以用直線方程，中間部門可用對數方程，而中后段可用四參數。免疫檢測時尺度點（可以是倍比稀釋的，也可以不2、設置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度，并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度，即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內，包括上限和下限。而對于呈 S型的標準曲線，盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度最陡段，即曲

52、線幾乎成直線的范圍內。是）濃度假如和相應的吸光度（OD）值假如能夠呈現直線關系當然是最理想的了，這時可以通過 EXELL 等利便的獲得擬合曲線，進而推算出樣品的濃度值。關于尺度曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數、對數等雖都可用于 ELISA及其它生物學反應中的曲線擬合，但合用于曲線的一部門，有的合用于前半段，有的合用于后半段，有的合用于段，而 Logistic 曲線則對曲線的全部都有較好的合用性。分，你想檢測的樣品濃度在曲線的哪一部分。當然，假如用于定量，仍是在段較好。但建模型是一回事，ELISA 試劑盒而用它來定量是另一回事。這些方法固然重要，但沒有一 種方法可以通用，但也都可以

53、用，也并不是說它就是萬能的。事實上不僅是 ELISA，其它生物學反應都是 S 形曲線，也都可以用 Logistic 曲線擬合。在 ELISA 實驗結束后，我們得到的是經酶標儀得出的標準品以及樣本的 OD 值。其中，標準品的濃度已知，我們可以利用標準品的 OD 值及其相對應的濃度，以 OD 值為橫坐標，濃度為縱坐標，做一條標準曲線，并用公式表示出來。這樣，我們把樣本的 OD 值以 X 值代入， 便可求出 Y 值，即樣本濃度。1、首先，將數據整理好輸入 Excel，分別為經酶標儀讀出標準品的 OD 值及其對應的濃度值。2、拖動鼠標選取完成的數據區，并點擊圖表向導，在圖表類型中選“XY 散點圖”，并

54、選擇子圖表類型的“散點圖”（第一個沒有連線的），如下圖所示。在一個長的區間內，Logistic 應該都能擬合得較為理想。假如用來定量，S 形曲線的中間段（較陡處）是比較好的，而兩真個平坦部門計算誤差會大，有時甚至會很大。用于免疫檢測的所謂“尺度曲線"實在稱為擬合曲線比較合適。目前國際上最流行的免疫檢測擬合方式是“四參數邏輯擬合"，用這種擬合方式往往能夠比較精確的反映濃度和吸光度的曲線關系， 從而進一步比較準確的獲得樣品中待測物質的濃度值。但我們做免疫檢測很少有時候能夠有這么理想的情況，標品濃度和相應 OD 值往往是"S"型的曲線關系，這時就不能用直線擬合的方式了，而對擬合方法進行選擇就是必要的了。關鍵在于你的尺度曲線做到了 S 形的哪一部3、點擊“”，出現如下圖界面。如是輸入是如本例橫向列表的就不用更改，如果是縱向列表就改選“列”。4、在做 ELISA 標準曲線，并通過此曲線求樣本濃度時，因樣本 OD 值是已知的，因此我們需要將 OD 值設為 X。根據上圖我們可以看到，橫坐標 X 值為 OD 值，縱坐標 Y 為標準品濃度，這正是