1、附件2細菌回復突變試驗Bacterial Reverse Mutation Assay1范圍本規范確定了細菌回復突變試驗的基本原則、要求和方法。本規范適用于化妝品原料及其產品的基因突變檢測。2 定義2.1 回復突變 reverse mutation細菌在化學致突變物作用下由營養缺陷型回變到原養型(prototroph)。2.2 基因突變 gene mutation在化學致突變物作用下細胞 DNA 中堿基對的排列順序發生變化。2.3 堿基置換突變 base substitution mutation引起 DNA 鏈上一個或幾個堿基對的置換。堿基置換有轉換(transition)和顛換(trans

2、version)兩種形式。轉換是 DNA 鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌呤被另一嘌呤所代替。顛換是 DNA 鏈上的一個嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個嘌呤被另一嘧啶所代替。2.4 移碼突變 frameshift mutation引起 DNA 鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。2.5 細菌回復突變試驗Bacterial reverse mutation assay利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗菌株測定引起細菌堿基置換或移碼突變的化學物質所誘發的氨基酸缺陷型原養型回復突變的試驗方法。2.6 S9經多氯聯苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和-萘黃酮結合誘導的大鼠制備肝勻漿，在9000g 下離心

3、10min 后的肝勻漿上清液。3原理鼠傷寒沙門氏組氨酸營養缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養基上，僅少數自發回復突變的細菌生長；大腸桿菌色氨酸營養缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培養基上，僅少數自發回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養缺陷型的細菌回復突變成原養 型，因而能生長形成菌落，據此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復突變，故需加入經誘導劑誘導的大鼠肝制備的 S9 混合液。4儀器和設備培養箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度 0.1g 和 0.0001g

4、)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計數器、低溫高速離心機，玻璃器皿等。5 培養基和試劑5.10.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液成分：L-組氨酸（MW155）78mgD-生物素（MW244）122mgL-色氨酸（MW204）102mg加蒸餾水至1000ml配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在 0.068MPa 下高壓滅菌 20min。貯于 4冰箱。若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。5.2頂層瓊脂培養基成分： 瓊脂粉1.2g氯化鈉1.0g加蒸餾水至 200mL配制：上述成分混合后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。實驗時，加入 0

5、.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液 20mL。若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。5.3Vogel-Bonner (V-B) 培養基 E成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O)100g磷酸氫二鉀(K2HPO4)500g磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O)175g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)10g加蒸餾水至1000mL配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至 1000mL。于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。儲于 4冰箱。5.420%葡萄糖溶液成分：葡萄糖200g加

6、蒸餾水至1000mL配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于 4冰箱。5.5底層瓊脂培養基成分：瓊脂粉7.5g蒸餾水480mLV-B 培養基 E10mL20%葡萄糖溶液10mL配制：首先將前兩種成分于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min 后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿 25mL 制備平板，冷凝固化后倒置于 37培養箱中 24h，備用。5.6營養肉湯培養基成分：牛肉膏2.5g胰胨5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)1.0g加蒸餾水至500mL配制：將上述成分混合后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。

7、儲于 4冰箱。5.7鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)成分：氯化鉀(KCl)61.5g氯化鎂(MgCl2·6H2O)40.7g加蒸餾水至500mL配制：在水中溶解上述成分后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。儲于 4冰箱。5.80.2mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH7.4)成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)2.965g磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)29.015g加蒸餾水至500mL配制：溶解上述成分后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。儲于 4冰箱。5.9S9 混合液成分每毫升 S9 混合液

8、肝 S9100l鹽溶液20l滅菌蒸餾水380l0.2mol/L 磷酸鹽緩沖液500l輔酶 II(NADP)4mol6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5mol配制：將輔酶 II 和 6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分， 使肝 S9 加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現配，并保存于冰水浴中。實驗結束，剩余 S9 混合液應該丟棄。5.10菌株鑒定用和特殊用途試劑5.10.1組氨酸-色氨酸-生物素平板成分：瓊脂粉15g 蒸餾水 934mL (V-B)培養基 E 20mL 20%葡萄糖 20mL 滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL滅菌鹽酸色氨酸水溶液

9、(0.5g/100mL) 10mL滅菌 0.5mmol/L 生物素溶液6mL配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌 20%葡萄糖，V-B 培養基、組氨酸溶液，加進熱的瓊脂溶液中（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水改為944ml）。待溶液稍微冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。5.10.2氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環素平板成分：瓊脂粉15g蒸餾水 930mL(V-B)鹽溶液20mL20%葡萄糖20mL滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL）10mL滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL滅菌 0.5mmol/L 生物素溶液6mL氨芐青霉素溶液(8mg/mL 于

10、0.02mol/LNaOH 中)3.15mL四環素溶液(8mg/mL 于 0.02mol/L HCl 中)0.25mL配制：瓊脂和水高壓滅菌 20min，將無菌的葡萄糖、VB 鹽溶液、組氨酸溶液和色氨酸溶液，加進熱的瓊脂溶液中，混勻（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水改為加940ml）。冷卻至大約 50，無菌條件下加入四環素溶液和/或氨芐青霉素溶液。應該在傾注瓊脂平板后幾天內，制備主平板。5.10.3營養瓊脂平板成分：瓊脂粉7.5g營養肉湯培養基500mL配制：于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min 后傾注平板。6試驗菌株及其生物學特性鑒定6.1試驗菌株采用以下菌株作為標

11、準組合：鼠傷寒沙門氏菌TA1535；鼠傷寒沙門氏菌TA97或TA97a或TA1537；鼠傷寒沙門氏菌TA98；鼠傷寒沙門氏菌TA100； 鼠傷寒沙門氏菌TA102 或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）；6.2生物學特性鑒定 新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標準，如表 1 所示。表 1試驗菌株鑒定的判斷標準菌株組氨酸缺陷色氨酸缺陷脂多糖屏障缺損氨芐青霉素抗性切除修復缺損四環素抗性自發回變菌落參考數*Ames實驗室Zeiger實驗室TA97+/+-90180*75200*TA97a+/+-90180*75200*TA98+/+

12、-30502050TA100+/+-10020075200TA102+/+-+240320*100400*TA1535+/+-+-1035520TA1537+/+-+-315520WP2uvrA/+/-+-/520WP2uvrA（pKM101）/+/+-/100200注“+”表示需 要組氨酸“+”表示需 要色氨酸“+”表示具 有 rfa 突變“+”表示具 有 R 因子“+”表示對于鼠傷寒沙門氏菌具有uvrB突變，對于大腸桿菌，具有uvrA突變“+”表示具 有 pAQ1 質粒*在體外代謝活化條件下自發回變菌落數略增。對于各菌的自發回變范圍，各個實驗室在參考其他實驗室數據的基礎上應建立自己的歷史對

13、照數據庫，形成適合本實驗室條件的適用范圍。同時，實驗室背景數據應當與文獻報道相符。6.2.1組氨酸缺陷/色氨酸缺陷原理：組氨酸缺陷型試驗菌株本身不能合成組氨酸，只能在補充組氨酸的培養基上生長，而在缺乏組氨酸的培養基上，則不能生長。色氨酸缺陷試驗菌株本身不能合成色氨酸，只能在補充色氨酸的培養基上生長，而在缺乏色氨酸的培養基上，則不能生長。鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸或者色氨酸培養基平板和無組氨酸或者色氨酸平板上劃線，于37下培養 24h 后觀察結果。結果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生長，而在無色氨酸平板上則

14、不能生長。6.2.2脂多糖屏障缺損 原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質,如結晶紫能穿透菌膜進入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液 0.1mL于營養瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的 0.1%結晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37下培養 24h 后觀察結果。結果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現一透明菌帶，說明該待測菌株具有 rfa突變。6.2.3氨芐青霉素抗性原理：含 R 因子的試驗菌株對氨芐青霉素有抗性。因為 R 因子不太穩定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質粒存在與否。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液 0.1

15、mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37下培養 24h 后觀察結果。結果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含 R 因子，否則，表示測試菌不含 R 因子或 R 因子丟失。6.2.4紫外線敏感性原理：具有uvrB/A突變的菌株對紫外線敏感，當受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復酶的菌株，則能照常生長。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液 0.1mL于營養瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離 33cm）8 秒鐘。置 37下孵育 24h 后觀察結果。結果判斷：具有uvrB/A 突變的菌株對紫外線敏感，經輻射后細菌不生長，而具有完整

16、的切除修復系統的菌株，則照常生長。6.2.5四環素抗性原理：具有 pAQI 的菌株對四環素有抗性。鑒定方法：吸取待測菌株增菌液 0.1mL 于氨芐青霉素/四環素平板上劃線，置 37下孵育 24h 后觀察結果。結果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素/四環素平板上生長，表明該測試菌株對氨芐青霉素和四環素兩者有抗性，具有 pAQI 質粒，否則，說明測試菌株不含 pAQI 質粒。 6.2.6自發回變原理：每種試驗菌株都以一定的頻率自發地產生回變，稱為自發回變。這種自發回變是每種試驗菌株的一項特性。鑒定方法：將待測菌株增菌液 0.1mL 加到 2mL含組氨酸-色氨酸-生物素的頂層瓊脂培養基的試管內（若試驗

17、中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸），混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置 37培養箱中孵育 48h 后記數每皿回變菌落數。結果判斷：每種標準測試菌株的自發回變菌落數應符合表 1 要求。經體外代謝活化后的自發回變菌落數，要比直接作用下的略高。6.2.7回變特性-診斷性試驗 原理：每種試驗菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質以及 S9 混合液的效應不一。鑒定方法：按照平板摻入試驗的操作步驟進行。將受試物換成診斷性誘變劑。結果判斷：標準菌株對某些診斷性誘變劑特有的回變結果參見表 2。表 2 測試菌株的回變性誘變劑劑量(g/皿)S9TA97TA98 TA100TA102TA1535TA1537WP

18、2uvrAWP2uvrA（pKM101）柔毛霉素6.0-1243123 47592/疊氮化鈉1.5-763 3000188320(0.5g)/ICR1911.0-164063 1850/鏈霉黑素0.25-inhinh inh2230/絲裂霉素 C0.5-inhinh inh2772/2,4,7-三硝基-9-芴酮0.20-83778244 40016/4-硝基-O-次苯二胺20-21601599 7980/4-硝基喹啉-N-氧化物0.5-528292 4220287/610/甲基磺酸甲酯1.0（l）-17423 27306586/敵克松50.0-26881198 183895/9-氨基吖啶50-

19、/337/2-氨基芴10+17426194 3026261/苯并（a）芘1.0+337143 937255/110(5g)/2-氨基蒽20+/ /380(5g)/300/注：inh 表示抑菌。7大鼠肝微粒體酶的誘導和 S9 的制備7.1 誘導選擇健康雄性成年大鼠，體重 200g左右。將多氯聯苯（PCB 混合物）溶于玉米油中，濃度為 200mg/mL，按 500mg/kg 體重一次腹腔注射，5d 后處死動物，處死前禁食 12h。也可采用苯巴比妥鈉和 -萘黃酮聯合誘導的方法進行制備。經口或腹腔注射給予80mg/kg 苯巴比妥鈉和 80mg/kg -萘黃酮，連續 3天，處死前禁食 16h。7.2 S

20、9 制備首先，用 75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結締組織，用冰浴的0.15mol/L氯化鉀溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/L氯化鉀溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/L氯化鉀溶液 3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機上，在 4條件下，以 9000g離心10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝 2mL-3mL。儲存于液氮生物容器中或-80冰箱中備用。上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進行。制備肝 S9 所用一切手術器械、器皿等，均經滅菌消毒。S9 制備后，其活力需經診斷性誘變劑進行鑒定。8溶劑的選擇如果受試物為水溶性

21、，可用滅菌蒸餾水作為溶劑；如為脂溶性，應選擇對試驗菌株毒性低且無致突變性的有機溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加 入量為 100l。9劑量的設計決定受試物最高劑量的標準是對細菌的毒性及其溶解度。自發回變數的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養物細菌存活數減少，都是毒性的標志。對原料而言，一般最高劑量組可為 5mg/皿或 5µl/皿。對產品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應設四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。1

22、0試驗操作步驟10.1增菌培養取營養肉湯培養基 5mL，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養物接種于營養肉湯培養基內，37振蕩（100 次/min）培養 10h。該菌株培養物應每毫升不少于 1-2×109 活菌數。10.2平板摻入法實驗時，將含0.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸）的頂層瓊脂培養基 2.0mL分裝于試管中，45水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液 0.1mL，受試物溶液 0.1mL和磷酸鹽緩沖液0.5ml或者 S9 混合液 0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入

23、底層瓊脂平板上，轉動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于 37培養箱里孵育 48h。記數每皿回變菌落數。實驗中，除設受試物各劑量組外，還應同時設空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。11數據處理和結果判斷記錄受試物各劑量組、空白對照（自發回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數，并求平均值和標準差。如果受試物TA1535、TA1537 、WP2uvrA的回變菌落數是溶劑對照回變菌落數的三倍或三倍以上，受試物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回變菌落數是溶劑對照回變菌落數的二倍或二倍以上，并出現以下情形之一，則該

24、受試物判定為致突變陽性，（1）呈劑量-反應關系（2）任何一個劑量條件下，出現陽性反應并有可重復性受試物經上述五個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加 S9 或未加 S9 條件下為陽性，均可報告該受試物細菌回復突變試驗為致突變陽性。如果受試物經五個試驗菌株檢測后，無論加 S9 和未加 S9 均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗修訂說明為進一步完善化妝品安全技術規范，針對規范實施中出現的問題，結合化妝品原料及產品安全性評價的要求，參考其他相關標準對化妝品安全技術規范（2015年版）中鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗相關內容進行修訂。一、修訂的必要性1.作為化妝品

25、安全技術規范的重要參考文獻食品安全國家標準GB 15193.4-2014細菌回復突變試驗已參考國際最新指導原則進行了修訂。2.化妝品安全技術規范規定試驗用菌株標準組合為TA97、TA98、TA100和TA102。OECD Guidelines for Testing of Chemicals： Bacterial reverse mutation test (No.471, 21st July 1997) 中推薦的菌株組合為：（1）S. typhimurium TA1535，and（2）S. typhimurium TA1537 or TA97 or TA97a，and（3）S. typhim

26、urium TA98，and（4）S. typhimurium TA100，and（5）E. coli WP2 uvrA，or E. coli WP2 uvrA (pKM101)，or S. typhimurium TA102.由于菌株TA1535對某些特殊的致突變物敏感，且TA1535（無質粒pKM101）可以與其R因子的衍生物TA100（有質粒pKM101）相互補充，故在化妝品安全技術規范規定試驗用菌株標準組合中需加入菌株TA1535。TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重復序列，其位于相應的組氨酸靶位點內的突變敏感部位，它們對導致這些移碼位點中堿基缺失的移碼誘變劑的敏感性相似

27、，因此該三種菌株在試驗中可相互代替。鼠傷寒沙門氏菌TA102 或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）在試驗中可以相互替代。ICH頒布的ICH S2(R1)、FDA頒布的Redbook2000和藥物遺傳毒性研究技術指導原則（2007年）中也遵循了OECD指導原則中對于菌株組合的要求，即TA1537、TA97和TA97a可以相互替代。TA97a是TA97的純化形式，1991年文獻報道TA97菌株在應用上存在以下缺點：過夜培養的菌液活性較低、背景菌落不明顯，平皿上回復突變產生的菌落較細小。其原因與該菌株的uvr B基因缺失有關。因此，Ames實驗室對TA97菌株進行了改進,

28、改進后的重組菌株命名TA97a以代替原來的TA97。改進后的TA97a生長特性較TA97好。目前TA97市場上已很難獲得，考慮到實際情況，且完善菌株組合使其更充分的反映出受試物的致突變性，需要對化妝品安全技術規范進行修改，增加TA1535、TA97a和TA1537作為試驗中菌株組合的選擇，制定更符合國情的化妝品安全技術規范。3.對于Ames試驗中使用的TA97，TA98，TA100和TA102菌株，化妝品安全技術規范給出了明確的自發回變菌落數。我國最新的食品安全國家標準細菌回復突變試驗（GB15193.4-2014）給出了Ames實驗室和Zeiger實驗室兩個實驗室的自發回復突變數的范圍供參考

29、，并且同時指出：對于各菌株的自發回變范圍，各個實驗室在參考其他實驗室數據的基礎上應建立自己的歷史對照數據庫，形成適合本實驗室的實用范圍。另外，國內相關檢驗規范及其他實驗室的背景數據都表明不同實驗室的菌株自發回復突變數是不同的。因此目前國際上的指導原則包括OECD471、ICH S2(R1)和FDA Redbook，均沒有規定菌株自發回復突變數的范圍。每個實驗室都應在參考其他實驗室數據的基礎上建立自己的歷史對照數據庫。就以上原因，需要對化妝品安全技術規范進行修改，要求各個實驗室建立自己的歷史對照數據庫，使其更具有科學性。4.化妝品安全技術規范中表2給出了不同菌株的陽性對照物作為參考，但未給出敵克

30、松的相關參考數據。敵克松已經作為一種常用的陽性對照物用于Ames試驗，國內很多實驗室用敵克松作為菌株的陽性對照，因此，需要對規范進行修改，增加敵克松的相關參考數據，使規范更加完整。5.修改了數據處理和結果判斷的內容，使表達更加清楚、明確。二、修訂依據及文獻1.化妝品衛生規范（2015年版）鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗2.食品安全國家標準 GB15193.4-2014細菌回復突變試驗3.OECD Guidelines for Testing of Chemicals：Bacterial reverse mutation test (No.471, 21st July 1997)4.ICH har

31、monised tripartite guideline S2(R1)：Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use. 20115.Bruce N. Ames, Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research. 113:173-215,19836.The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. M

32、utation Research,455:29-60, 2000三、起草原則1.參考國內和國際上關于鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗指導原則，以及國內實際情況，結合化妝品原料及產品安全性評價的要求，修訂鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗方法。2.充分考慮國情。根據我國化妝品衛生規范的要求對某些內容進行具體化和明確化，使指導原則切實可行。3.在撰寫過程中，還注意了科學性、合理性、協調性和有效性，以及通俗性和規范性之間的關系。 鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗編制說明 一、編制說明本次修訂，主要變化如下修改了試驗名稱；修改了1 試驗范圍；修改了2.5 細菌回復突變的定義；修改了3 試驗原理內容；修改了5.1 組

33、氨酸-生物素配制的方法；修改了5.2頂層瓊脂培養基配制方法；修改了5.10.1組氨酸-生物素平板的制備方法；修改了5.10.2氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環素平板的制備方法；修改了6.1試驗菌株內容；修改了表1試驗菌株鑒定的內容；修改了6.2.1組氨酸缺陷/色氨酸缺陷 原理；修改了6.2.4紫外線敏感性的種類；修改了6.2.6鑒定方法；修改了表2 測試菌株的回變性內容；修改了10.2 平板摻入法內容；修改了11數據處理和結果判斷的內容。二、確定相關技術內容及新舊技術規范的對比新修訂的鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗修改了試驗用菌株的要求，菌株鑒定的內容，相關試劑配制的內容，數據處理和結果判斷的內

34、容，與原方法的差異如下表所示。表 主要內容修訂簡表編號試驗項目原方法現方法改動情況序號內容序號內容1題目8 鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay8 細菌回復突變試驗Bacterial Reverse Mutation Assay修改試驗名稱2范圍1本規范 確定了鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗的基本原則、要求和方法1本規范確定了細菌回復突變試驗的基本原則、要求和方法修改試驗名稱3定義2.5鼠傷寒沙門氏菌/回復突變試驗salmonella typhimurium/reverse mutation assay2.5細

35、菌回復突變試驗Bacterial reverse mutation assay修改試驗名稱4定義2.5利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗菌株測定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學物質所誘發的組氨酸缺陷型(his-)原養型(his+)回復突變的試驗方法2.5利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗菌株測定引起細菌堿基置換或移碼突變的化學物質所誘發的氨基酸缺陷型原養型回復突變的試驗方法修改定義5原理3鼠傷寒沙門氏組氨酸營養缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養基上，僅少數自發回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養缺陷型的細菌回復突變成原養型，因而能生長形成菌落，據此判斷受試物是否為致

36、突變物3鼠傷寒沙門氏組氨酸營養缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養基上，僅少數自發回復突變的細菌生長；大腸桿菌色氨酸營養缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培養基上，僅少數自發回復突變的細菌生長。假如有致突變物存在，則營養缺陷型的細菌回復突變成原養型，因而能生長形成菌落，據此判斷受試物是否為致突變物增加大腸桿菌的試驗原理6培養基和試劑5.10.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液5.10.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液增加色氨酸7培養基和試劑5.2配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅

37、菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液20mL5.2配制：上述成分混合后，于 0.103MPa 下高壓滅菌 30min。實驗時，加入  0.5mmol/L 組氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L 生物素溶液 20mL 增加色氨酸配制方法8培養基和試劑組氨酸-生物素平板組氨酸-色氨酸-生物素平板增加組氨酸-色氨酸-生物素平板配制方法9氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環素平板滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)修改氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環素平板配制方

38、法10試驗菌株6.1采用 TA97、TA98、TA100和TA102一組標準測試菌株6.1采用以下菌株作為標準組合：鼠傷寒沙門氏菌TA1535；鼠傷寒沙門氏菌TA97或TA97a或TA1537；鼠傷寒沙門氏菌TA98；鼠傷寒沙門氏菌TA100； 鼠傷寒沙門氏菌TA102 或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）增加了菌株的選擇11生物學特性鑒定6.2無6.2（1）TA97a、TA1535、TA1537、WP2uvrA和WP2uvrA（pKM101）鑒定的判斷標準（2）自發回變菌落數在參考其他實驗室數據的基礎上應建立自己的歷史對照數據庫，形成適合本實驗室條件的適用范圍。同時，實驗室背景數據應當與文獻報道相符增加了TA97a、TA1535、TA1537、W