1、熒光定量熒光定量PCRPCR技術在臨床技術在臨床醫學研究中的應用及注意事項醫學研究中的應用及注意事項內內 容容 提提 要要一、基因診斷技術在醫學檢驗中的地位二、熒光探針定量PCR在臨床醫學中的應用三、熒光探針定量PCR在臨床醫學中的主要問題基因診斷的基因診斷的物質基礎及物質基礎及與其它與其它診斷方法的診斷方法的區別區別基因診斷免疫學診斷臨床診斷細胞膜細胞核DNA轉錄 mRNA翻譯蛋白質臨床表現生化診斷臨床實驗醫學發展臨床實驗醫學發展 三個時代三個時代 標志技術標志技術 性質性質生化診斷時代 生化分析 表象免疫學診斷時代 酶免、放免 表象分子(基因)診斷時代 基因體外擴增(PCR) 本質1、病原

2、體的定量檢測及藥物療效考評（HBV）2、腫瘤基因和腫瘤標志物表達(mRNA)的檢測（P53 ）3、遺傳病基因的檢測（地中海貧血 ）4、與疾病相關的各種蛋白質的基因表達的定量檢測6、建立病原體的分子診斷標準熒光定量熒光定量PCRPCR在臨床醫學中的應用在臨床醫學中的應用熒光定量熒光定量PCRPCR在病原體檢測中的應用在病原體檢測中的應用一、肝炎病毒定量檢測二、性病病原體檢測三、優生優育相關項目檢測四、結核桿菌及呼吸道病原體檢測五、其他病原體檢測病毒性肝炎概況 病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起，以肝臟炎癥和壞死病變為病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起，以肝臟炎癥和壞死病變為主的一組傳染病。按病毒的生物學

3、特征、臨床和流行病學特征，主的一組傳染病。按病毒的生物學特征、臨床和流行病學特征，1989年在日本東京的國際肝炎學術討論會上，將其分為甲（年在日本東京的國際肝炎學術討論會上，將其分為甲（A）型、乙（型、乙（B）型、（）型、（C）型、丁（）型、丁（D）型、戊（）型、戊（E）型肝炎，以后）型肝炎，以后還報道了己（還報道了己（F）型和庚（）型和庚（G）型。）型。 我國是個肝炎大國，病毒性肝炎發病數位居法定管理傳染病的我國是個肝炎大國，病毒性肝炎發病數位居法定管理傳染病的第一位，僅乙型肝炎病毒感染者就達第一位，僅乙型肝炎病毒感染者就達1.2億，每年新增加的感染億，每年新增加的感染者也在百萬以上，丙肝發

4、病率亦趨上升。慢性乙型肝炎病程遷者也在百萬以上，丙肝發病率亦趨上升。慢性乙型肝炎病程遷延，如得不到及時的治療，部分將會發展為肝硬化甚至肝癌，延，如得不到及時的治療，部分將會發展為肝硬化甚至肝癌，嚴重危害人類健康。嚴重危害人類健康。HBV基因型與血清型關系及流行病基因型與血清型關系及流行病學分布學分布基基因因型型血清學亞型血清學亞型基因長基因長度度(nt)臨床突變率臨床突變率主要主要流行地域流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Badw2ayw1321550（常）（常）T185816東南亞、中國、東南亞、中國、日本日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr;adw2321

5、550（常）（常）T1858或或C185858（常）（常）東南亞、中國、東南亞、中國、日本、澳洲、日本、澳洲、美國美國病原學病原學乙型肝炎檢測標志物lHBsAg，抗-HBslHBeAg，抗-Hbel抗HBclHBV-DNA乙型肝炎免疫檢測和PCR結果異同 “大三陽” PCR結果陰性 抗-HBs陽性，PCR結果陽性熒光定量PCR技術對性傳播疾病的檢測一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原體、解脲脲原體（CT、UU）(有證）三、梅毒螺旋體（TP）四、單純庖疹病毒（HSV）五、乳頭瘤病毒（HPV）（有證）六、人類免疫缺陷病毒（HIV）PCR技術對性傳播疾病檢測的注意事項1標本的選取 TP HSV 2臨床療

6、效考評 超高倍熒光定量熒光定量PCRPCR診斷TORCH綜合征傳統的TORCH病原體：TOX, other, RV, CMV, HSV新近發現的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘帶狀 庖疹V、腸道V、乙肝V、丙肝V、 HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、 人微小病毒B19等TORCHTORCH感染的實驗室診斷感染的實驗室診斷一、組織培養：慢，費力，陽性率低二、血清學診斷： IgG： IgM： 1、不能定量分析 2、抗體的產生受多種因素的影響 3、產生假陽性三、基因診斷方法 原理：檢測TORCH病原體的核酸 優點：1、客觀指標 2、敏感性、特異性高 3、定量指標 熒光定量PCR在TORCH診斷中

7、的應用： 1、篩選TORCH的患者 2、建立TORCH的分子診斷標準熒光定量熒光定量PCRPCR技術檢測技術檢測TOX孕婦TOX感染的危害 孕早期（多少，也可對樣本稀釋后再檢測；如低于此范圍，則報告多少，如103拷貝數/ml，而不能報告為0拷貝數/ml或陰性。 拷貝數與病原體的關系：拷貝數與病原體的數量成正相關 。一般來說細菌是多拷貝的，病毒是單拷貝的。 DNA拷貝數單位和質量單位：100拷貝HBV0.04fg 國際單位IU拷貝數拷貝數/ml/ml的確定：的確定：DNA/RNA 參考品（質粒等）參考品（質粒等）測量OD260的值得到mg/ml通過與分子量的計算，得到拷貝數/ml 不同實驗室得到

8、的結果差別很大。HCVHCV國際單位與拷貝數換算國際單位與拷貝數換算NGI NGI SuperQuant:SuperQuant: 1 IU/mL = 3.4 copies/ml1 IU/mL = 3.4 copies/ml (NGI Product License Application to FDA ) (NGI Product License Application to FDA )Roche Roche Amplicor Monitor v2.0Amplicor Monitor v2.0 1 1 IU/mL = IU/mL = 0.9 copies/ml0.9 copies/ml (Ro

9、che Molecular Systems) (Roche Molecular Systems)Cobas Amplicor Monitor HCV v2.0Cobas Amplicor Monitor HCV v2.0 1 IU/mL = 2.7 copies/ml1 IU/mL = 2.7 copies/ml (Roche Molecular Systems) (Roche Molecular Systems)LCx HCV RNA Quantitative AssayLCx HCV RNA Quantitative Assay 1 IU/mL = 3.8 copies/ml1 IU/mL = 3.8 copies/ml (Abbott Diagnostics)(Abbott Diagnostics)Bayer bDNA 3.0:Bayer bDNA 3.0: 1 IU/mL = 5.2 copies/ml1 IU/mL = 5.2 copies/ml (Bayer Development Group)(Bayer Development Group) 未知未知HCV RNA 樣本樣本甲實驗室 5000拷貝/ml 乙實驗室 10000拷貝/ml 丙實驗室 50000拷貝/ml 丁實驗室 20000拷貝/ml 實驗室結果的互通性實驗室結果的互通性20