1、腎綜合征出血熱患者軟腭粘膜對(duì)乳鼠致病性的研究         【摘要】目的探討腎綜合征出血熱(HFRS)的發(fā)病機(jī)理。方法23天的近交系Balb/C乳鼠，腦內(nèi)接種早期HFRS重癥患者軟腭粘膜出血點(diǎn)組織懸液，用套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)乳鼠腦、肺及腎組織中的HFRS病毒RNA。結(jié)果接種乳鼠發(fā)病死亡，剖檢顯示，發(fā)病乳鼠各器官呈現(xiàn)明顯微血管系統(tǒng)和實(shí)質(zhì)組織病變，乳鼠腦、肺及腎組織中HFRS病毒RNA陽性。結(jié)論早期HFRS患者軟腭粘膜出血點(diǎn)組織中含有HFRS病毒。   【Abstract】ObjectiveTo

2、 expiore the pathogenic mechanism of hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS).Methods2-3 days old inbred Balb/C suckling mice were inoculated intracerebrally with tissue suspension of soft parate petechia of HFRS patients and the HFRS virus RNA was tested in brain, lung and kidney tissues of suck

3、ing mice by nested PCR.ResultsSome of the mice developed acute disease and died. The autopsy analysis indicated that these mice showed pathological changes in system microvascular and parenchymatous tissues. HFRS virus RNA was detected in their brains, lungs and kidney tissues.ConclusionsThese resul

4、ts indicate that HFRS virus exists in the tissue of petechial hemorrlngic spots on soft palate petechia of HFRS patients. 【Key words】Suckling mouseHemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS)Soft palatePetechiaPolymerase chain reacti on 腎綜合征出血熱(HFRS)是一種由腎綜合征出血的熱病毒(HFRSV)引起的以幾種鼠類為宿主的嚴(yán)重傳染病1。我們?cè)鴪?bào)道了一組經(jīng)血清

5、學(xué)證實(shí)的HFRS患者，在臨床上軟腭粘膜均有大小不等的出血點(diǎn)并以此作為臨床早期診斷的指標(biāo)2，3。應(yīng)用電鏡技術(shù)在數(shù)例患者軟腭粘膜組織中找到了病毒顆粒，膠體金檢測(cè)亦呈現(xiàn)陽性結(jié)果4，5。此發(fā)現(xiàn)首次證實(shí)了口腔軟腭磷狀上皮細(xì)胞屬HFRSV侵襲的靶細(xì)胞。1982年Tsai等報(bào)道經(jīng)乳鼠腦內(nèi)接種HFRSV可致其發(fā)病死亡，這種乳鼠模型沿用到今6。常規(guī)的乳鼠模型都是用HFRS病毒株使其致病，直接用出血熱患者軟腭粘膜組織制成懸液對(duì)乳鼠作腦內(nèi)注射，目前尚未見報(bào)道。為了進(jìn)一步探討腎綜合征出血熱患者口腔軟腭出血的發(fā)病機(jī)理及確證HFRSV的新定位，我們采取HFRS患者軟腭出血點(diǎn)組織對(duì)乳鼠直接進(jìn)行腦內(nèi)接種，觀察其對(duì)乳鼠的致病性

6、。 1材料和方法 1.1組織取材臨床上確診為HFRS的早期住院患者。臨床分型：重型1例，中型2例(按1986年南京EHF學(xué)術(shù)會(huì)議標(biāo)準(zhǔn))。患者的軟腭均有獨(dú)特的出血點(diǎn)于出血點(diǎn)處常規(guī)消毒，持活檢鉗夾取大小約1 mm×1 mm×1 mm粘膜組織數(shù)塊，置于200目鋼網(wǎng)上研磨。加入常規(guī)量青霉素，10%小牛血清，Eagle氏液(pH7.4)，混勻制成10%懸液，2 0003 000 r/min離心1520 min，取上清，液氮存放待檢。取材局部粘膜用10%硝酸銀燒灼止血，生理鹽水涂洗23遍，觀察片刻無出血傾向即可。 1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組23天體重為1.551.65 g的 Balb/C乳鼠

7、50只(河南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。分為5組，每組10只，第1組乳鼠腦內(nèi)注射0.02 ml生理鹽水；第2組乳鼠腦內(nèi)接種0.02 ml重型HFRS患者軟腭粘膜組織懸液；第3、4組乳鼠腦內(nèi)接種0.02 ml中型HFRS患者軟腭粘膜組織懸液；第5組乳鼠腦內(nèi)直接注射0.02 ml A16株HFRS病毒懸液；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組乳鼠均由母鼠喂養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況。 1.3RNA的提取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組乳鼠的腦、肺及腎組織各30 mg，PBS緩沖液沖洗后加入1 mlGIT緩沖液進(jìn)行勻漿。用蛋白酶K-SDS液消化(蛋白酶K， 100 g/ml;SDS, 0.5%)37溫育30分鐘。采用酚-氯仿法提取RNA7。 1

8、.4套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Nested-PCR)Nested-PCR試劑盒購于第四軍醫(yī)大學(xué)基因診斷技術(shù)應(yīng)用研究所。第1對(duì)引物：(1)5-GAGATGATCATCAGGTTCAA-3，(2)5-GTGATAACATGGATCCTGAG-3；第2對(duì)引物：(1)5-TTGCTGATGTGATGGCAGTCTCT-3，(2)5-AAGCTTTAGTAGTAGACTCC-3。利用該引物對(duì)可特異性地?cái)U(kuò)增出位于HFRSV高度保守區(qū)序列的430 bp的基因條帶。第1次擴(kuò)增：反應(yīng)體系為50 l, 其中含有20 mmol/L RNA抽提液，0.5 mol/L第1對(duì)引物，40 U的RNase,5.6 U鳥成骨髓瘤病毒

9、逆轉(zhuǎn)錄酶，10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),1.5 mmol/L MgCl2,0.01%明膠，200 mol/L dNTP;反應(yīng)程序：94熱啟動(dòng)60 s，隨后94變性35 s，55退炎45 s，72延伸50 s，循環(huán)36次，最后一次循環(huán)的延伸時(shí)間為200 s。第2次擴(kuò)增：含5 l第1次PCR產(chǎn)物，0.5 mol/L第2對(duì)引物，其他條件同第一次。反應(yīng)結(jié)束后取10 l擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0%的瓊脂糖凝膠電泳(5-7V/cm，20 min)。在紫外燈下觀察結(jié)果，根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。       &

10、#160;    2結(jié)果 2.1感染乳鼠的臨床表現(xiàn)及發(fā)病情況分析乳鼠多在接 種后69天發(fā)病：背部弓起，行動(dòng)遲緩，體重不增或增長遲緩，精神萎靡，卷縮和昏迷。繼而兩側(cè)后肢僵直，終至死亡。剖檢乳鼠可見其胸腔內(nèi)有少量積液，兩肺充血或見斑塊狀出血灶，肝、腎及腦膜血管充血，各臟器之間有輕度粘連。第1組注射重型HFRS患者軟腭粘膜組織懸液的乳鼠及第5組陽性對(duì)照組全部發(fā)病死亡。另外兩組注射中型HFRS患者軟腭粘膜組織懸液的乳鼠及陰性對(duì)照組未見異常。結(jié)果表明HFRS患者口腔軟腭粘膜出血點(diǎn)組織對(duì)乳鼠具有一定程度的致病性。 2.2套式-PCR對(duì)發(fā)病乳鼠臟器組織的檢測(cè)分析實(shí)驗(yàn)組

11、及對(duì)照組各臟器組織的PCR檢測(cè)結(jié)果，從第2組注射重型HFRS患者軟腭粘膜組織懸液乳鼠的腦、肺、腎組織及第5組陽性對(duì)照腎組織中均擴(kuò)增出大小為430 bp的目的基因條帶，而陰性對(duì)照組及注射中型HFRS患者軟腭粘膜組織懸液的乳鼠臟器組織呈現(xiàn)陰性結(jié)果。3討論 業(yè)已知道，HFRS病毒在機(jī)體內(nèi)的靶細(xì)胞具有顯著的廣泛性。我們經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐與基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)：HFRS患者軟腭粘膜出血點(diǎn)陽性率為100%，并在3例重型HFRS患者軟腭出血點(diǎn)處找到了病毒顆粒，從而證實(shí)口腔軟腭磷狀上皮細(xì)胞屬EHF侵襲的靶細(xì)胞4。 HFRS病毒作腦內(nèi)接種，對(duì)乳鼠具有高度的致病性6。本實(shí)驗(yàn)采用1例重型，2例中型HFRS患者軟腭粘膜組織懸

12、液對(duì)乳鼠作腦內(nèi)注射，結(jié)果重型組乳鼠全部發(fā)病死亡，并且剖檢顯示各器官呈現(xiàn)明顯微血管系統(tǒng)和實(shí)質(zhì)組織的病變，進(jìn)一步用套式PCR對(duì)乳鼠腦、肺及腎組織懸液進(jìn)行了檢測(cè)，擴(kuò)增出目的基因條帶，從而再一次證實(shí)了口腔軟腭粘膜鱗狀上皮細(xì)胞是HFRS病毒侵襲的靶細(xì)胞，為王素琴等3關(guān)于HFRS臨床早期診斷指標(biāo)的觀點(diǎn)提供了進(jìn)一步的依據(jù)；中型HFRS患者軟腭粘膜組織懸液對(duì)乳鼠沒有致病性，套式PCR檢測(cè)亦示陰性結(jié)果，該現(xiàn)象的作用機(jī)制尚不清楚，目前正在探索中。 參考文獻(xiàn) 6Tsai T F, Bauer S, McCormick J B. Intracerebral inoculation of suckling mice with Hantan