1、傅立葉變換離子回旋共振質譜分析與鑒定骨橋蛋白的多肽片段         11-04-23 13:23:00     編輯：studa20               作者：蔣鑫萍 程舸 于雷 王韶 劉曉梅 石磊【摘要】  采用高效液相色譜(HPLC)SCX及C4色譜柱從人乳樣品的乳清部分分離與純化出骨橋蛋白(Osteoponti

2、n, OPN)，在一定條件下將其用胰蛋白酶酶解后，利用高分辨傅立葉變換離子回旋共振質譜(FTICRMS)，結合微噴霧(Nanospray)技術，并借助Mascot軟件數據庫，獲得了OPN相關多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的質譜結構信息，分析了其裂解機理。研究表明，利用FTICRMS并結合HPLC等化學方法，可以高效、快速地分離與純化人乳樣品中的OPN，借助Mascot軟件數據庫進行質譜分析，能夠簡潔、準確地鑒定相關多肽片段的結構信息，為OPN多肽片段不同翻譯后修飾位點的確定與其生物學活性關系的研究提供了理論依據。 【關鍵詞】  傅立葉變換離子回旋共振質譜，人乳，

3、骨橋蛋白，多肽片段1 引 言隨著現代生物技術的進步和生命科學的發展，多肽在生物體內的生理功能越來越受到重視，從天然產物中獲得具有生物活性多肽類物質的方法也不斷發展。骨橋蛋白(Osteopontin, OPN)是一種重要的多功能細胞外基質蛋白1，能在骨組織細胞、巨噬細胞、上皮細胞等多種細胞上表達2，在介導細胞的趨化、粘附、增殖和遷移，以及骨組織的礦化與重建、免疫調節、信號傳導等方面起著重要作用3,4。OPN是一種含精氨酸甘氨酸天冬氨酸(ArgGlyAsp, RGD)帶負電荷的分泌型糖基化磷蛋白，其中包含16個氨基酸的信號肽，剪切后形成298個氨基酸的成熟蛋白，理論分子量約為33 kDa。但由于高

4、度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以達到75 kDa5,6。OPN含有多個與整合素結合的功能域，磷酸化后的OPN主要是以RGD結構與細胞表面的整合素受體(1，3)結合，SVVYGLR多肽位點可以結合41，47和91，而未磷酸化的OPN則不依賴于RGD結構與某些CD44的變異體結合，OPN和細胞表面受體相互作用能誘導信號傳導，從而促進細胞的粘附和遷移710。在類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis, RA)的病灶中會出現OPN的過度表達，它可能通過調節病灶部位細胞因子的分泌來調控RA病理過程中的炎癥反應11,12，并且由于病因不同以及與藥物的作用將導致OPN細微結構的復雜化，即會出

5、現不同位點磷酸化或糖基化修飾的OPN多肽片段。因此，從OPN中典型的多肽片段入手，尋找RA中促炎癥作用調控網絡起關鍵作用的炎癥因子靶點，對于深入認識RA的發病機理和研發新的RA藥物具有重要的指導作用。傅立葉變換離子回旋共振質譜(FTICRMS)以高分辨率、高質量檢測上限、高掃描速度、寬的動態范圍和高質量準確度等技術優勢1315，越來越廣泛地應用到生命科學，特別是在生物大分子的研究中。同時，以基質輔助激光解吸離子化技術和電噴霧離子化技術為代表的新型離子化方法也給FTICRMS拓展了更廣泛的應用空間。迄今為止，蛋白質組學研究策略主要包括 “Bottom Up” 和 “Top Down” 兩種方法。

6、“Top Down” 是在蛋白質水平上鑒定和研究蛋白質，將完整的蛋白質分子離子有效地解離以獲得蛋白質翻譯和翻譯后修飾及蛋白質非共價鍵復合物等結構信息16。而 “Bottom Up” 是在多肽水平上鑒定和研究蛋白質，對蛋白質純度要求不需象二維電泳純化的蛋白那么高，即可將蛋白質酶解成多肽后再進行分析，覆蓋率可達100%，不僅增強了鑒定的可信度，也能更好地鑒定蛋白質翻譯后的修飾位點17,18。本研究采用 “Bottom Up” 并結合HPLC和配有Nanospray技術的高分辨FTICRMS等化學方法，快速分離并純化了人乳中的OPN，借助Mascot軟件數據庫進行質譜分析，準確鑒定了OPN中有代表性

7、的多肽片段GDSVVYGLR和QNLLAPQTLPSK的質譜裂解機理。2 實驗部分2.1 儀器與試劑7.0 T傅立葉變換離子回旋共振質譜儀(FTICRMS，Thermo公司); 超高速離心機(美國Alfa Wassermann公司);高壓液相色譜(美國Waters公司); SCX和C4色譜柱(Sigma公司)。尿素、DDT、TFA、碘化乙酰胺、胰蛋白酶、檸檬酸、檸檬酸銨和乙腈均購自Sigma公司;其它試劑均為國產分析純。2.2 骨橋蛋白的分離與純化將人乳樣品從-20 冰箱中取出，室溫放置2 h后，量取若干樣品于Eppendorf管中，以14000 r/min離心45 min，溫度控制在不超過0

8、 。離心處理后，參看分離與純化人乳的流程(圖1)，將人乳樣品進行初步的分離，得到乳脂部分、乳清部分和乳粒部分。OPN在中層的乳清部分中，除去酪蛋白后的乳清蛋白，采用高效液相色譜配有SCX柱進行初步分離得到8個組分。首先將跟蹤、鑒定出OPN的SCX5和SCX6組分合并，然后繼續用C4色譜柱進行HPLC分離，最終純化出乳清部分的蛋白OPN。2.3 蛋白質樣品酶解5 g OPN樣品與90 L 0.1 mol/L NH4HCO3, 20 L 6 mol/L尿素、4 L 100 mmol/L DDT在56 共同孵育1 h，冷卻至室溫使其變性與降解。加入4 L 500 mmol/L碘化乙酰胺于室溫孵育30

9、 min進行烷化反應。加入100 L 0.1 mol/L NH4HCO3并同時加入胰蛋白酶，于37 孵育16 h消化降解。加入4 L 100%乙酸和81 L 0.1%乙酸，進行淬火反應使反應終止，蛋白OPN即被酶解為多肽片段。2.4 色譜與質譜條件3 結果與討論3.1 骨橋蛋白的分離3.2 骨橋蛋白中多肽片段的鑒定 將純化后樣品OPN利用胰蛋白酶在溫和條件下進行酶解，利用FTICRMS串聯質譜(MS/MS或MSn)，母離子的活化采取碰撞激發解離(CAD)和電子捕獲誘導解離(ECD)的方式，根據多肽碎片命名規則以及CAD的CN肽鍵斷裂和ECD的NC斷裂在裂解機理上的互補性規律(圖解3)，借助Ma

10、scot軟件數據庫進行質譜分析，分別鑒定了OPN蛋白中有代表性的雙電荷分子離子峰為m/z 483.2570的多肽片段和雙電荷分子離子峰為m/z 655.3816的多肽片段。在雙電荷分子離子峰為483.2570多肽片段的CAD譜圖(圖1a)中，主要得到b與y離子的信息，b+4：m/z 359.1561，b+5：m/z 458.2245，b+6：m/z 621.2882，b+7：m/z 678.3093，y+2：m/z 288.2031，y+3：m/z 345.2245，y+4：m/z 508.2878，y+5：m/z 607.3561，y+6：m/z 706.4238，y+7：m/z 793.4566，初步證明所含的多肽GDSVVYGLR片