1、無菌檢查驗證方案編制： 日期：審核： 日期： 批準： 日期： 文件編號： 文件受控：XXXX有限公司年 月 日無菌檢查驗證方案驗證方案：一驗證目的：確認供試品所采用的檢查方法和檢查條件下無抑菌作用，以保證微生物的充分檢出，確保檢驗方法科學性、檢驗結果準確性。二.驗證依據：GB/T14233.22005醫用輸液、輸血、注射器具檢驗方法 第2部分：生物學試驗方法中國藥典2010版三.驗證頻次：檢驗條件發生改變時、檢驗方法發生改變時、檢驗人員發生改變時、進行再驗證，如果一切都沒發生改變時一年進行一次。四職責：4.1生產技術部制定驗證方案。4.2質量部按照驗證方案執行。五.驗證小組成員：組長：組員：六

2、實施日期：七.資料保存：由質管科保存5年。八.檢驗方法：1.無菌室消毒：如果無菌室很久沒有使用，在使用之前用乳酸或甲醛消毒，正常使用化驗室的情況下，每月要消毒一次，使用六個月要更換消毒劑，按消毒劑的說明書的濃度、時間、方法進行消毒，化驗員對地面進行消毒清擦，工作臺面用75%的酒精進行消毒，在化驗員進入之前，紫外線照射30min,在開啟空調30min。2.化驗員進入化驗室過程：化驗員在一更除去外衣進入潔凈間進行洗手間洗手、手消毒、穿潔凈工作服，進入二更、緩沖間、進入準備間，在準備間穿無菌工作服進入菌檢室。3.主要設備：超凈工作臺，光學顯微鏡、恒溫培養箱、恒溫水浴箱、壓力蒸汽滅菌器、電熱干燥箱。4

3、.培養基配制及滅菌、器具滅菌.營養肉湯培養基的制備及滅菌，按照說明書制備培養基及滅菌。流體硫乙醇酸鹽培養基制備及滅菌，按照說明書制備及滅菌。改良馬丁培養基制備及滅菌，按照說明書制備及滅菌。接觸的器具采用可靠的滅菌方法，置壓力蒸汽滅菌器內121，30分鐘，或置于電熱干燥箱里180，2小時。5.無菌室檢查：直徑為9厘米培養皿，無菌操作注入融化的營養瓊脂培養基約15 mL -20mL,在30-35培養48小時，3只培養基在無菌室操作臺平均位置打開蓋，暴露30分鐘后蓋好蓋，倒置30-35培養48小時后取出檢查，3只培養基上生長的菌落數平均應不超過1個。6.培養基無菌檢查：每批培養基隨機抽取不少于10只

4、，5支置于30-35，另取5支置于20-25培養14天，均應無菌生長。檢查可在供試品無菌檢查前或和供試品的無菌檢查同時進行。7.培養基的靈敏度檢查培養基靈敏度檢查用菌株傳代次數不得超過5代，試驗用枯草芽孢桿菌種應采用適宜的菌種保存技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特征。菌液制備：接種枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中（或營養瓊脂培養基上）在30°C-35°C培養18小時至24小時，培養物用0.9%氯化鈉溶液，每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液，菌懸液在室溫下放置2小時內使用。培養基接種：取3支管，每管裝12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基，其中2管接種小于100cf

5、u枯草芽孢桿菌，另1支管做空白對照液，置30°C-35°C培養3天，結果判定，空白對照管應無菌生長，加菌的培養基均生長良好，判該營養基的靈敏度檢查符合規定。8.無菌檢查：將滅好的生物指示劑用無菌操作法，將其放入裝有10ml營養肉湯培養基的試管中，每個生物指示劑放入一個試管中，其中有一試管的培養基作空白對照液，再取一試管營養肉湯培養基放入沒滅菌的枯草桿菌芽孢菌片，作為陽性對照，置入33°C-37°C培養7天，逐日觀察，并記錄是否有菌生長。如果加滅好生物指示劑在培養過程中，培養基出現渾濁，不能從外觀上判斷有無菌生長，可取該培養液適量轉種至新鮮的營養肉湯培養基

6、中及營養瓊脂斜面上33°C-37°C培養2天，觀察是否有菌生長或取培養（物）涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時作菌種鑒定。9.結果判斷：陽性對照管的菌應生長良好，陰性對照管不得有菌生長，否則，試驗無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判定供試品符合規定。若供試品管中任何一管渾濁并證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含，試驗若經確認無效，應重試。10.重試的過程：產品數量：同一批號10支單位產品。浸提介質：質量濃度9g/L無菌氯化鈉。供試液制備：管類器具：按管內表面積每10cm2加入提介質1ml，振搖數次，流量

7、約為10ml/min, 容器類器具：按容器內表面積每10cm2加入提介質1ml，振搖數次。培養基的無菌檢查：每批培養基隨機抽取不少于10支，5支置30°C-35°C，另5支置20°C-25°C培養14天，均無菌生長，檢查可在供試品無菌檢查前或和供試品的無菌檢查同時進行。供試品有無抑菌作用取硫乙醇酸鹽流體培養基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，生胞梭菌各2管，取改良馬丁培養基4管，每管裝置10ml，小于100cfu的白色念球菌，黑曲霉各2管。其中1管接入1ml供試液，另1管作為對照。細菌置30°C-35&

8、#176;C，真菌置20°C-25°C培養3天至5天，逐日觀察菌的生長情況，結果判斷：與對照管比較，如含供試品各管試驗菌生長良好，則說明供試品該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任何一種管試驗菌生長微弱，緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量，增加培養基用量，使用中和劑消除供試品抑菌作用。靈敏度檢查：菌種：培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003銅綠假單胞菌（Pseudom

9、onas aeruginosa）CMCC(B)10104枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501生胞梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC(B)64941白色念球菌（Candida albicans）CMCC(B)98001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(B)98003菌液制備：接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，接種生胞梭菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基中，30°C-35°C培養18小時至24小時；接種白色念球菌的新

10、鮮培養物至至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，20°C-25°C培養24小時至48小時，上述培養物用0.9%氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于10cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基上，23°C-28°C培養5天7天，加入3ml5ml無菌的含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數小于100cfu的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2°C-8°C可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2°C-8°C，在驗證過的貯存期內使

11、用。培養基接種：取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生胞梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，置30°C-35°C培養3天；取每管裝置為9ml的改良馬丁培養基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，置30°C-35°C培養3天，取每管裝置為9ml的改良馬丁培養基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，置20°C-25°C培養5天。逐日觀察結果。結果判定：空白對照管應無

12、菌生長，若加菌的培養基管均生長良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。供試品接種培養和觀察接種6支試管，其中4管裝硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝置15ml，另2管裝改良馬丁培養基每管裝置10ml，在6支試管中分別接入1ml供試液，同時作陽性對照和陰性對照。培養及觀察：將上述接種后的硫乙醇酸鹽流體培養基平均分成兩份，一份置30°C-35°C培養14天，另一份與接種后的改良馬丁培養基置20°C-25°C培養14天，培養期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長，如在加入供試液后或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14天后，不能從外觀上判斷有無菌生長，可取該培養液適量的轉種至

13、同種新鮮培養基中及營養瓊脂斜面和改良馬丁瓊脂斜面培養基上，細菌培養2天，真菌培養3天，觀察接種的同種新鮮培養基及營養瓊脂和改良馬丁瓊脂斜面培養基上是否有菌生長或培養液（物）涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時作菌種鑒定。結果判斷：陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長，否則，試驗無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確定無菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時方可判試驗結果無效；無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求。回顧無菌試驗

14、過程，發現有可能引起微生物污染的因素。供試品管中生長的微生物經鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規定；若有菌生長，判供試品不符合規定。產品留樣無菌檢查按此方法執行，第一次試驗，可再重復試驗一次，若合格，則合格，再次長菌為不合格。驗證方案的實施1. 按照驗證方案進行消毒、按照人員進入程序進入。以三個批號的產品為例進行驗證。2. 以一次性使用輸液器 帶針，規格/型號:IS-G0.55*21(mm),生產批號：20120402滅菌批號：20120403A1，滅菌批量,31332套

15、;一次性使用輸液器 帶針,規格/型號:IS-G0.60*24(mm), 生產批號20120406，滅菌批號：20120407 A1生產批量31332套;一次性使用輸液器 帶針，生產批號20120411, 滅菌批號：20120412 A1,規格/型號:IS-G0.7*25(MM)，生產批量31332為例：A. 培養基無菌檢查：A1培養基的制備：營養肉湯培養基：生產企業：北京奧博星生物技術有限責任公司，批號201302182013.03.25取營養肉湯培養基18克，加入到蒸餾水1000毫升，加熱煮沸溶解，調節PH值，分裝每管裝10ML營養肉湯培養基，121在高壓滅菌鍋內滅菌15分鐘備用。 A2培養

16、基無菌檢查：2013.03.25將滅好的5管培養基10ml營養肉湯培基置入36°C培養7天，逐日觀察，均無菌生長。B. 培養基的靈敏度檢查培養基靈敏度檢查用菌株傳代次數不得超過5代，試驗用枯草芽孢桿菌種應采用適宜的菌種保存技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特征。菌液制備：201接種枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中在34°C培養24小時，培養物用0.9%氯化鈉溶液稀釋，每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液，菌懸液在室溫下放置2小時內使用。培養基接種：取3支管，每管裝10ml的營養肉湯培養基，其中2管接種小于100cfu枯草芽孢桿菌，另1支管做空白對照液，置34&

17、#176;C培養3天，結果判定，空白對照管無菌生長，加菌的培養基均生長良好，該營養基的靈敏度檢查符合規定。C.無菌檢查：將滅好的生物指示劑用無菌操作法，將其放入裝有10ml營養肉湯培養基的試管中，每個生物指示劑放入一個試管中，其中有一試管的培養基作空白對照液，再取一試管營養肉湯培養基放入沒滅菌的枯草桿菌芽孢菌片，作為陽性對照，置入36°C培養7天，逐日觀察，并記錄是否有菌生長。結果判斷：陽性對照管的菌應生長良好，陰性對照管不得有菌生長，否則，試驗無效。若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判定供試品符合規定。若供試品管中任何一管渾濁并證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分

18、證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含，試驗若經確認無效，應重試。枯草桿菌黑色芽胞變種培養記錄序號： 記錄編號：AF-JL-008產品名稱一次性使用輸液器 帶針菌片名稱枯草芽胞桿菌ATCC9372規格型號IS-G 0.55X21(mm)菌片批號20120818生產批號及批量 20130402 31332套菌片數11片滅菌批號20130403A1培養基名稱營養肉湯培養基滅菌數量 31332套檢驗日期2013.04.0303.10培養溫度37無菌室菌落數接種管號陽性陰性1234567891011培養溫度37培養天數及結果1+-碟號1232+-24h菌落數0003+-48h菌落數0004+-平

19、均數05+-結果判定無菌室合格6+-7+- 檢驗人： 復核人： XXXX有限公司枯草桿菌黑色芽胞變種培養記錄序號： 記錄編號：AF-JL-008產品名稱一次性使用輸液器 帶針菌片名稱枯草芽胞桿菌ATCC9372規格型號ISG 0.6X24(mm)菌片批號20120818生產批號及批量20130406 31332套菌片數11片滅菌批號20130407A1 培養基名稱營養肉湯培養基滅菌數量31332套檢驗日期2013.04.0704.14培養溫度37無菌室菌落數接種管號陽性陰性1234567891011培養溫度37培養天數及結果1+-碟號1232+-24h菌落數0003+-48h菌落數0004+-

20、平均數05+-結果判定無菌室合格6+-7+- 檢驗人： 復核人： XXXX有限公司枯草桿菌黑色芽胞變種培養記錄 序號： 記錄編號：AF-JL-008產品名稱一次性使用輸液器 帶針菌片名稱枯草芽胞桿菌ATCC9372規格型號ISG0.7X25(mm)菌片批號20120818生產批號及批量20130411 31332套 菌片數11片滅菌批號20130412A1 31332套培養基名稱營養肉湯培養基滅菌數量31332套檢驗日期2013培養溫度37無菌室菌落數接種管號陽性陰性1234567891011培養溫度37培養天數及結果1+-碟號1232+-24h菌落數0003+-48h菌落數0004+-平均數

21、05+-結果判定無菌室合格6+-7+- 檢驗人： 復核人： XXXX有限公司九無菌試驗另一種方法：1.改良馬丁培養基：生產企業;北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：.硫乙醇酸鹽流體培養基：生產企業;北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：2.按照無菌驗證方案進行無菌車間消毒，人員進出程序進入。3. 具體檢驗方法：產品數量：取一次性使用無菌注射器 帶針，規格/型號：2ML0.5(MM)生產批號：20130105，生產批量4800支，滅菌批號：20130106滅菌批量：4800支，取10支單位產品。規格/型號：5ML0.6(MM)生產批號：20080618，生產批量40000支，滅菌批號：2013

22、0619滅菌批量：40000支，取10支單位產品。規格/型號：5ML0.6(MM)生產批號：20130701，生產批量50000支，滅菌批號：20130702滅菌批量：50000支，取10支單位產品。浸提介質：質量濃度9g/L無菌氯化鈉。供試液制備：容器類器具：按容器內表面積每10cm2加入提介質1ml，振搖數次。培養基的無菌檢查：2013.03.17A.取硫乙醇酸鹽流體培養基29.2克加入1000毫升蒸餾水中，加熱煮沸溶解，調PH值，分裝，12ML裝一管，115高壓滅菌30分鐘備用，每批培養基隨機抽取不少于10支，5支置30°C-35°C，另5支置20°C-25

23、°C培養14天，均無菌生長。B. 取改良馬丁培養基29克加入1000毫升蒸餾水中，加熱煮沸溶解，調PH值，分裝，9ML裝一管，115高壓滅菌30分鐘備用，每批培養基隨機抽取不少于10支，置20°C-25°C培養14天，均無菌生長。供試品有無抑菌作用2013.03.28.取硫乙醇酸鹽流體培養基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌，生胞梭菌各2管，取改良馬丁培養基4管，每管裝置10ml，小于100cfu的白色念球菌，黑曲霉各2管。其中1管接入1ml供試液，另1管作為對照。細菌置35°C培養3天，真菌置25°C培

24、養5天，逐日觀察菌的生長。結果判斷：與對照管比較，含供試品各管試驗菌生長良好，則說明供試品該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。靈敏度檢查：菌種：培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC(B)10104枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501生胞梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC(B)64941白色念球菌（Candi

25、da albicans）CMCC(B)98001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(B)98003菌液制備：2013.03.26.接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，接種生胞梭菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，35°C培24小時；接種白色念球菌的新鮮培養物至至改良馬丁培養基中25°C培養至48小時，上述培養物用0.9%氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于10cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基上，28°C培養7天，加入3ml5ml無菌的含0.05%（v/v）聚山梨酯80的

26、0.9%氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數小于100cfu的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2°C-8°C可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2°C-8°C，在驗證過的貯存期內使用。培養基接種：取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基9支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生胞梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，置35°C培養3天；取每管裝置為9ml的改良馬丁培養基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，置35°C培養3天，取每

27、管裝置為9ml的改良馬丁培養基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，置25°C培養5天。逐日觀察結果。結果判定：空白對照管應無菌生長，加菌的培養基管均生長良好，該培養基的靈敏度檢查符合規定。供試品接種培養和觀察接種6支試管，其中4管裝硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝置15ml，另2管裝改良馬丁培養基每管裝置10ml，在6支試管中分別接入1ml供試液，同時作陽性對照和陰性對照。培養及觀察：將上述接種后的硫乙醇酸鹽流體培養基平均分成兩份，一份置35°C培養14天，另一份與接種后的改良馬丁培養基置25°C培養14天，培養期間應逐日觀察并記錄是否有菌生長。結果判斷：陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長，否則，試驗無效。無 菌 檢 驗 記 錄 序號： AF-JL-007樣品名稱： 一次性使用無菌注射器 帶針 規格型號： 2ML0.5MM 生產批號 ： 生產批量： 4800支 滅菌批號： 滅菌批量： 4800支 檢驗日期 ： 201304.0304.17 檢驗數量： 10支 檢驗依據： 包裝驗證方案 培養培養基名稱陽性對照陰性對照需氣、厭氣菌培養基霉菌培養基凈 化 臺 菌 落 數溫 度3035202520