1、生e網專業的生物成果轉化、交易平臺（）           2010.11.20    09:30簡簡單單2006: 您好,我現在準備用ELISA法夾心法測人血清中IL-1,IL-6,CRP,TNF,但是對具體操作還有些很低級的問題,請問:1.預實驗時,標準品的濃度怎樣確定?梯度做幾個,需要做空白孔嗎?復孔要做嗎?2.樣本的梯度作幾個?稀釋倍數確定的依據時什么?3.我測的樣本中TNF量很低,國外有人用高敏試劑盒,國內有用化學發光法,您知道有沒有更經濟的方法?多謝!請

2、問簡簡單單2006：雙抗夾心法中，最后TMB用硫酸終止，測量OD450的時候是用單波長450nm還是雙波長測量？如果是后者，參考波長是哪個？630nm可以嗎？我陰性陽性血清都是從1：50開始被比稀釋，到1：25600，陽性OD值都在1.0以上，1.7以下。陰性值在0.3以下。0.2的不多，多數在0.1及其以下。我的血清效價這么高，但是怎么OD值到不了別人說的2或者3呢？簡簡單單2006：謝謝你的幫助我是用間接ELISA檢測人補體C1q 抗體，還想請教簡簡單單2006我的預實驗是這樣的1、用pH9.6,0.05M的碳酸鹽稀釋抗原C1q,10ug/mL,5ug/mL,2.5ug/mL100uL/孔

3、，4度過夜，PBST洗板三次2、用10%的小牛血清（pH7.2的PBS），200uL/孔，37度3h,PBST洗板三次3、加入陰陽性血清100uL/孔，37度，2h，PBST洗板五次4、 PBST(含1%的小牛血清)稀釋酶標記的羊抗人IgG1:10000,1:20000, 1:40000,100uL/孔 ,37度，半小時結果：   10ug/mL  5ug/mL  2.5ug/mL1:10000 +   0.983  0.740  0.7141:10000 - &#

4、160; 0.577  0.676  0.5761:10000空白 0.180  0.134  0.0971:20000 +   0.508  0.506  0.3671:20000 -   0.333  0.385  0.3131:20000空白 0.085  0.094  0.0781:40000 +   0.331 

5、60;0.379  0.2291:40000 -   0.233  0.303  0.2611:40000空白0.061  0.068  0.06請簡簡單單2006幫忙分析，謝謝。用Elisa試劑盒的時候我該怎么選擇包被濃度，酶的濃度以及封閉的條件如何，多謝簡簡單單2006 :你好我們現在的實驗是從肝組織勻漿中檢測TNF-a,但好幾次預試的結果,TNF-a的含量都超過了Elisa試劑盒的上限,我們的Elisa試劑盒是從晶美買的,肝勻漿的濃度從 1:10 1:20 1:40 到

6、1:100 1:200都沒有很大的區別,勻漿用的是PBS,勻漿方法用的是先用勻漿器研碎,再在-86度冰箱反復凍融3次,其余均嚴格按Elisa試劑盒內說明操作,請問這可能是哪一步出了問題?或是肝勻漿本身也會導致假陽性結果?如何才能解決?謝謝了,在線等!簡簡單單2006 :你好能不能說一點點關于Elisa試劑盒保護液的配方。gsljz wrote:請問樓主：我想自己做某個抗原成份的elisa試劑，即自己包被酶標板，沒有抗原做標準品怎么辦？是否需要去買？做ELISA試劑一定要有標準品，沒有的話就無法評價這個試劑的好壞。你的抗原成分是從什么來源的？想辦法自己做一點可以嗎？shunshun wrote:

7、簡簡單單2006: 您好,我現在準備用ELISA法夾心法測人血清中IL-1,IL-6,CRP,TNF,但是對具體操作還有些很低級的問題,請問:1.預實驗時,標準品的濃度怎樣確定?梯度做幾個,需要做空白孔嗎?復孔要做嗎?2.樣本的梯度作幾個?稀釋倍數確定的依據時什么?3.我測的樣本中TNF量很低,國外有人用高敏試劑盒,國內有用化學發光法,您知道有沒有更經濟的方法?多謝!標準品最好是買國家標準品然后自己稀釋，如果沒有，可以自己稀釋了以后找一些國際公認的定量試劑盒來定標。標準品最好做復孔，特別在試驗初期，如果你的顯色劑很穩定的話，空白孔可做可不作。在自己試驗時標準品濃度可以不用太多，三個（高中低）即

8、可。你樣本中TNF的量低到什么程度，一般好的ELISA可以測到ng級別，再小的話就不行了。化學發光法以及比較經濟了，你還可以試試生物素親和素放大的酶免法，可以提高很多靈敏度的。kcid wrote:請問簡簡單單2006：雙抗夾心法中，最后TMB用硫酸終止，測量OD450的時候是用單波長450nm還是雙波長測量？如果是后者，參考波長是哪個？630nm可以嗎？如果有條件的話，就用雙波長 450，630如果沒有，單波長也可以crystal2006 wrote:我陰性陽性血清都是從1：50開始被比稀釋，到1：25600，陽性OD值都在1.0以上，1.7以下。陰性值在0.3以下。0.2的不多，多數在0.

9、1及其以下。我的血清效價這么高，但是怎么OD值到不了別人說的2或者3呢？如果你的1：50 OD是1.7， 到了1：25600，OD還有1.0以上的話，這個結果或者你的系統有問題，你是用什么稀釋的，稀釋液的OD是多少？coloursofwind wrote:簡簡單單2006：謝謝你的幫助我是用間接ELISA檢測人補體C1q 抗體，還想請教簡簡單單2006我的預實驗是這樣的1、用pH9.6,0.05M的碳酸鹽稀釋抗原C1q,10ug/mL,5ug/mL,2.5ug/mL100uL/孔，4度過夜，PBST洗板三次2、用10%的小牛血清（pH7.2的PBS），200uL/孔，37度3h,PBST洗板三

10、次3、加入陰陽性血清100uL/孔，37度，2h，PBST洗板五次4、 PBST(含1%的小牛血清)稀釋酶標記的羊抗人IgG1:10000,1:20000, 1:40000,100uL/孔 ,37度，半小時結果： 10ug/mL 5ug/mL 2.5ug/mL1:10000 + 0.983 0.740 0.7141:10000 - 0.577 0.676 0.5761:10000空白 0.180 0.134 0.0971:20000 + 0.508 0.506 0.3671:20000 - 0.333 0.385 0.3131:20000空白 0.085 0.094 0.0781:40000

11、+ 0.331 0.379 0.2291:40000 - 0.233 0.303 0.2611:40000空白0.061 0.068 0.06請簡簡單單2006幫忙分析，謝謝。我該怎么選擇包被濃度，酶的濃度以及封閉的條件如何，多謝1）在包被過程和封閉以后，洗1次就可以了2）你這個結果說明你的酶標抗體和包被的反應板有一些非特異性吸附，建議你將封閉換成1的BSA或者5的脫脂奶粉，在酶標抗體的稀釋液中將小牛血清的濃度增加到20。3）間接法的話，血清需要稀釋，你的陰性、陽性血清稀釋了嗎，如果沒有的話，建議1：10到1：100，不同的稀釋度你試試。如果你本來沒有，要稀釋后再做的話，根據你目前的結果，估計

12、你要提高包被濃度或者酶標抗體濃度。yangji wrote:簡簡單單2006 :你好我們現在的實驗是從肝組織勻漿中檢測TNF-a,但好幾次預試的結果,TNF-a的含量都超過了試劑盒的上限,我們的試劑盒是從晶美買的,肝勻漿的濃度從 1:10 1:20 1:40 到1:100 1:200都沒有很大的區別,勻漿用的是PBS,勻漿方法用的是先用勻漿器研碎,再在-86度冰箱反復凍融3次,其余均嚴格按試劑盒內說明操作,請問這可能是哪一步出了問題?或是肝勻漿本身也會導致假陽性結果?如何才能解決?謝謝了,在線等!這個我沒有做過，不知道肝勻漿本身是否會導致假陽性結果，你可以試試看用1：200勻漿后得到的勻漿液再

13、用PBS稀釋，稀釋的比例大一些，再用試劑盒測一下，會有什么結果？天天知道 wrote:簡簡單單2006 :你好能不能說一點點關于保護液的配方。這個比較不方便非常感謝！簡簡單單2006 :你好，向您請教幾個我一直都沒有弄明白的幾個問題，謝謝！1、我看見有的夾心ELISA試劑盒中檢測抗體和捕獲抗體為一種抗體，而不是分別針對待測抗原的不同表位的一對抗體。我不理解的地方是：捕獲抗體把抗原上的表位都結合完了，檢測抗體怎么能與抗原結合呢？2、在網上可以搜索到有關夾心ELISA檢測TNF、CEA、IL2、IL8等說明書（都是來源于第四軍醫大學的產品），我發現它們所用的稀釋液配方都不一樣，差別很大。TNF-a

14、的稀釋液：PBS 100ml；BSA(牛血清白蛋白) 0.1g。IL-6的稀釋液：洗滌液 100ml ; BSA(牛血清白蛋白) 0.1g。IL-8的稀釋液：洗滌液 100 ml；PEG(聚乙二醇，MW6000) 3.0g。我想知道是根據什么原則來選擇稀釋液的組成？有沒有可以通用的啊？謝謝！簡簡單單2006，你好！我是干臨床的，對實驗不熟悉，有幾個簡單的問題想請教一下：要測血清VEGF水平，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法，試劑盒是96孔的，我要大概測5060個患者，收集病例需要時間，請問血清最長可以在冰箱里放置多長時間？另外分多少次做比較合適？謝謝！我用PBST加了1%BSA作為稀釋液。稀釋

15、液的OD值沒有測過，但是用同樣的稀釋液作其他的樣品就不是這樣子的。八月桂花 wrote:簡簡單單2006 :你好，向您請教幾個我一直都沒有弄明白的幾個問題，謝謝！1、我看見有的夾心ELISA試劑盒中檢測抗體和捕獲抗體為一種抗體，而不是分別針對待測抗原的不同表位的一對抗體。我不理解的地方是：捕獲抗體把抗原上的表位都結合完了，檢測抗體怎么能與抗原結合呢？2、在網上可以搜索到有關夾心ELISA檢測TNF、CEA、IL2、IL8等說明書（都是來源于第四軍醫大學的產品），我發現它們所用的稀釋液配方都不一樣，差別很大。TNF-a的稀釋液：PBS 100ml；BSA(牛血清白蛋白) 0.1g。IL-6的稀釋

16、液：洗滌液 100ml ; BSA(牛血清白蛋白) 0.1g。IL-8的稀釋液：洗滌液 100 ml；PEG(聚乙二醇，MW6000) 3.0g。我想知道是根據什么原則來選擇稀釋液的組成？有沒有可以通用的啊？謝謝！1)正常情況下，雙抗體夾心法中使用的包被抗體和酶標記抗體肯定不是同一個抗體，如果是同一個的話，會有很強的競爭，應該是無法做的。你是怎么知道別人試劑盒中使用的是同一個抗體的呢，這應該是無法了解的呀？2）稀釋液基本上是和所使用的原料有關，不同的原料組成的檢測相同物質的試劑盒所使用的稀釋液就可能不同。從你提供的數據看，IL-6的稀釋液應該只比TNF-a多了個Tween20而已，差別不是很大

17、。至于選BSA還是PEG那就和原料有很大關系了omphalos wrote:簡簡單單2006，你好！我是干臨床的，對實驗不熟悉，有幾個簡單的問題想請教一下：要測血清VEGF水平，采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法，試劑盒是96孔的，我要大概測5060個患者，收集病例需要時間，請問血清最長可以在冰箱里放置多長時間？另外分多少次做比較合適？謝謝！這要看你測的VEGF最血清中是否穩定了crystal2006 wrote:我用PBST加了1%BSA作為稀釋液。稀釋液的OD值沒有測過，但是用同樣的稀釋液作其他的樣品就不是這樣子的。你這個結果重復過嗎，有一個原則，就是你往低濃度稀釋的話，OD值肯定應該會下降

18、，且如果系統工藝好的話，應該可以稀釋到0.1以下的，因為低于試劑盒的靈敏度了，如果你怎么稀釋都有1.0，那肯定是哪里出問題了我的這個結果重復過多次，不是永遠稀釋都降不下去，可以降下去的。我想問的就是為什么我效價這么高的血清1：50稀釋的OD值都不是2以上呢？我從來沒有做到2.0以上的值！還有一個問題，就是我配TMB時是用DMSO配成10mg/ml來用，但是最近兩次配TMB時，配好放到4度后總是凝起來了，感覺像是溫度太低凍住了，不知是什么原因？簡簡單單2006:您好我買的CRP的試劑盒靈敏度為1.6ng/ml, 文獻中我所測的樣本中crp的濃度大致在0.18-7.97mg/l,而試劑盒中標準品的

19、濃度是配好的,分別為:10,30,100,250,500ng /ml,這樣我預試驗時標準品應該怎樣選擇呢,做幾個梯度呢?樣本我想用原濃度,還需要再做稀釋嗎?同樣的IL-6試劑盒靈敏度為2pg/ml,而文獻中濃度范圍在0.92-2.85pg/ml, 試劑盒推薦標準品的濃度為:250pg/ml,125, 62.5, 31.5, 15.625, 7.8pg/ml,預試驗應該怎樣選擇標準品和樣本的呢?簡簡單單2006:您好我們實驗室有做 Western用的一抗和二抗，請問可以用來做ELISA嗎？（一抗是鼠單抗，二抗羊抗鼠抗體HRP）步驟：1、蛋白包被到板上；2、一抗孵育3、二抗孵育4、顯色請問可以這樣

20、做嗎？簡簡單單2006:您好!我前段時間做了ELISA，測的是小鼠星形膠質細胞培養上清液內NGF和BDNF的值，參考國外文獻用ELISA是可以測的。我買的是美國MARKET公司的用于測小鼠血清的成品試劑盒，是雙抗夾心法。我按產品說明書上的方法步驟做了兩遍，結果都差不多。所測樣本的OD值都近似于標準品為0 pg/ml孔的值。我所測的標準品的值與說明書上提供的還比較接近，且近成直線。我所收集的樣本也是參考國外文獻用的是無血清培養基培養兩天后收集的是我的樣本的問題還是試劑盒 的問題？還是我的實驗方法？。讓人郁悶，請指教一二。crystal2006 wrote:我的這個結果重復過多次，不是永遠稀釋都降

21、不下去，可以降下去的。我想問的就是為什么我效價這么高的血清1：50稀釋的OD值都不是2以上呢？我從來沒有做到2.0以上的值！還有一個問題，就是我配TMB時是用DMSO配成10mg/ml來用，但是最近兩次配TMB時，配好放到4度后總是凝起來了，感覺像是溫度太低凍住了，不知是什么原因？如果一直都達不到2.0以上的結果，可能和你的原料有關。shunshun wrote:簡簡單單2006:您好我買的CRP的試劑盒靈敏度為1.6ng/ml, 文獻中我所測的樣本中crp的濃度大致在0.18-7.97mg/l,而試劑盒中標準品的濃度是配好的,分別為:10,30,100,250,500ng /ml,這樣我預試

22、驗時標準品應該怎樣選擇呢,做幾個梯度呢?樣本我想用原濃度,還需要再做稀釋嗎?同樣的IL-6試劑盒靈敏度為2pg/ml,而文獻中濃度范圍在0.92-2.85pg/ml, 試劑盒推薦標準品的濃度為:250pg/ml,125, 62.5, 31.5, 15.625, 7.8pg/ml,預試驗應該怎樣選擇標準品和樣本的呢?0.18-7.97mg/l相當于0.18-7.97ug/ml，做定量試驗的時候標準品都是要做的，這樣才能夠得到準確的結果，你要估計一下樣品的濃度稀釋到100250ng/ml左右，如果估計不出，就按你的范圍的上下限分別稀釋到大概這個濃度。同樣的IL-6試劑盒靈敏度為2pg/ml，而你的

23、標本濃度在0.92-2.85pg/ml，這說明你的這個試劑盒不太能滿足你這個標本的檢測需要，靈敏度偏低，你可能需要更靈敏的試劑盒才能得到準確的結果healthlee wrote:簡簡單單2006:您好我們實驗室有做 Western用的一抗和二抗，請問可以用來做ELISA嗎？（一抗是鼠單抗，二抗羊抗鼠抗體HRP）步驟：1、蛋白包被到板上；2、一抗孵育3、二抗孵育4、顯色請問可以這樣做嗎？一抗包被，蛋白是被測物，加入二抗（酶標記抗體）即雙抗體夾心法，你可以看看相關資料yjwjxxw wrote:簡簡單單2006:您好!我前段時間做了ELISA，測的是小鼠星形膠質細胞培養上清液內NGF和BDNF的值

24、，參考國外文獻用ELISA是可以測的。我買的是美國MARKET公司的用于測小鼠血清的成品試劑盒，是雙抗夾心法。我按產品說明書上的方法步驟做了兩遍，結果都差不多。所測樣本的OD值都近似于標準品為0 pg/ml孔的值。我所測的標準品的值與說明書上提供的還比較接近，且近成直線。我所收集的樣本也是參考國外文獻用的是無血清培養基培養兩天后收集的是我的樣本的問題還是試劑盒 的問題？還是我的實驗方法？。讓人郁悶，請指教一二。如果你有其它標準品的話，就可以驗證一下試劑盒是否準確。在沒有其它任何標本的情況下，而試劑盒又比較可靠的話，我只能說你的標本可能有問題。還要請教您一個問題，我測IL-1.IL-6,TNF,CRP細胞因子，用血漿和血清哪個更好？如果必須用血漿用什么抗凝劑影響小？ 非常感謝簡簡單單2006 做過多肽包被嗎，有什么樣的心得想交流一下簡簡單單2006 您好，我正在做一個檢測風濕病指標的試劑盒，用的是間接法。但做下來老感覺陰性值偏高，大部分為0.10.2，也有大于0.2的。通過拉大血清和酶標抗體的稀釋度，可以把陰性值降下去，但陽性值也跟著降。我現在想通過一種辦法，拉大陰陽性的差距，同時降低陰性值，望指教！我的實驗程序如下：（1）用包被液（CBS）稀釋包被抗原，10g/ml。（2）將加有抗原的包被液加入各孔，100l/孔。（3）4 16-18h.（4）甩去包被液，洗板三次，拍干，加