1、RNA病毒擴增檢測的質控品和標準品研究進展RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒(HIV)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）等的核酸檢測對于感染的早期診斷和抗病毒治療療效的動態觀察具有重要價值。自1983年發明聚合酶鏈反應（PCR）技術以來，出現了基因擴增的概念。目前多采用核酸擴增 李金明 衛生部北京醫院，衛生部臨床檢驗中心，100730，北京 RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒(HIV)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）等的核酸檢測對于感染的早期診斷和抗病毒治療療效的動態觀察具有重要價值。自1983年發明聚合酶鏈反應（PCR）技術以來，

2、出現了基因擴增的概念。目前多采用核酸擴增技術（NAT）來檢測病毒RNA，最常用的是逆轉錄（RT）-PCR方法。核酸擴增檢測要想得到可靠的結果，必須要使用質控品進行嚴格的質量控制，要對病毒進行定量測定，通常還須有病毒RNA標準品。目前RNA病毒擴增檢測的質控品和標準品可分為兩大類，一是裸露的RNA片段，二是內含特定RNA的病毒樣顆粒或稱之為帶盔甲的RNA(armored RNA)。 一、裸露的RNA 裸露的RNA即沒有任何蛋白包裹的RNA片段。其通常將特定的RNA病毒擬擴增RNA的 cDNA經體外轉錄的方式進行構建后，得到一種與相應cDNA互補的RNA（cRNA）。 cRNA的構建方法基本上是首

3、先將所需的RNA逆轉錄為cDNA，再經PCR擴增后，產物DNA片段經T載體克隆入相應的質粒載體，然后再構建入含T7啟動子的載體，體外逆轉錄得到相應的cRNA1-5。這種裸露的RNA即可用作為相應RNA RT-PCR測定的質控品和定量標準品。 裸露的RNA構建方法簡單，可通過OD260nm波長下比色進行準確定量。其缺點是：（1）穩定性差，難于保存1-3。cRNA片段完全暴露于外界環境中，很容易被環境中的核糖核酸酶（RNase）所降解。（2）cRNA由相應模板DNA逆轉錄產生，原有模板DNA的“污染”很難通過加DNase消化去除5。（3）不能監測樣本中RNA病毒顆粒的裂解效率。cRNA直接暴露于樣

4、本溶液中，無法模擬和監測真正的病毒顆粒的核酸提取過程1-5。由于上述原因，cRNA質控品和標準品很難在臨床RNA病毒RT-PCR檢測中實際應用，目前僅限于一些文獻報道1-5。 二、內含特定RNA的病毒樣顆粒或帶盔甲的RNA(armored RNA) 已知某些RNA病毒如MS2噬菌體、煙草花葉病毒（TMV）的外殼可以耐受RNase的作用，因此，如將特定的RNA序列包裹到這些病毒外殼內，就可以使其免受環境中RNase的降解，同時，在應用過程中還可以模擬病毒顆粒監測核酸提取過程中的病毒裂解效率。 1包裹于MS2噬菌體包膜蛋白內的RNA MS2噬菌體屬于正極性單鏈RNA球形病毒，基因組全長3569堿基

5、對，編碼成熟酶蛋白、包膜蛋白、復制酶蛋白和裂解蛋白等四種蛋白質分子。噬菌體由180包膜蛋白單體、一分子成熟酶蛋白和一分子基因組RNA組成。在較早期的大腸桿菌病毒MS2噬菌體包膜蛋白的研究中，發現包膜蛋白與操縱子RNA序列有特異性相互作用，這種作用可引發噬菌體外殼的組裝，同時，將噬菌體基因組RNA包裝到包膜內。因此，如果將特定病毒RNA的cDNA克隆于MS2噬菌體包膜蛋白基因序列cDNA下游，并在其下游插入終止子，轉錄后得到帶有噬菌體操縱子RNA序列的特定病毒RNA轉錄本，隨后操縱子RNA序列就可以引發噬菌體包膜蛋白組裝成外殼，并將攜帶有特定病毒RNA序列的部分噬菌體基因組包裝到包膜內，構成噬菌

6、體病毒樣顆粒。在構建質粒表達載體時，需將噬菌體成熟酶蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆表達于表達載體啟動子下游，經過誘導表達后，所表達的包膜蛋白不僅僅作為病毒樣顆粒的結構成分，而且可作為基因表達調節因子和pac信號對表達過程進行調節，使包膜蛋白的表達和RNA的轉錄協調一致，組裝所得噬菌體樣顆粒具有成熟特性，從而具有RNase抗性6-7。 國外及我們的研究8-13將編碼MS2噬菌體相應蛋白的cDNA序列連接到表達載體如pET28b T7啟動子下游，經過誘導表達得到成熟酶蛋白和包膜蛋白，在成熟酶以及噬菌體基因組RNA片段的協同作用下，組裝得到了耐RNase的病毒樣顆粒。據此，我們成功構建了表達載體

7、pI NCCL，并經原核表達后，得到的病毒樣顆粒具有耐RNase的特性12。我們將HCV RNA13、HIV RNA和SARS-CoV RNA等的cDNA序列構建于該質粒載體中的MS2噬菌體1.9kb基因組下游，經轉化細菌表達后，即可得到具有耐RNase的特性的內含特定RNA的病毒樣顆粒。現我們亦已完成構建腫瘤標志物如前列腺特異抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）的mRNA的病毒樣顆粒的表達載體。由于pI NCCL表達載體的通用性，可以預見其在涉及RNA的標準品和質控品的研制中將具有極為廣闊的應用前景。 2包裹于煙草花葉病毒（TMV）包膜蛋白內的RNA 將特定的病毒RNA序列的cDNA與煙草花葉

8、病毒（TMV）的包膜基因序列cDNA一起克隆連接到表達載體，誘導表達包膜蛋白并組裝成病毒樣顆粒。早已有報道說可以將外源基因插入植物病毒如TMV等病毒基因組中進行高水平表達14。在誘導表達過程中，外源基因表達產物隨同組裝的TMV顆粒一起組裝到病毒顆粒內。在將外源基因序列克隆到病毒基因組的過程中，既要注意病毒基因組的組成又要注意引入外源基因序列的位點，這樣可以確保病毒基因組可以引發包膜蛋白的組裝，并且使組裝成的顆粒具有成熟特性，即RNase抗性，同時，確保引入的外源基因序列不會在重組過程中發生丟失現象。 使用內含特定RNA的病毒樣顆粒或帶盔甲的RNA做為RNA病毒RT-PCR檢測的質控品和標準品，

9、具有下述幾個方面的優點：（1）無生物傳染危險性。（2）作為RNA RT-PCR檢測的標準品和質控品具有很好的穩定性。（3）在核酸提取中，對病原體內RNA有很好的模擬作用。由于表達產物為噬菌體樣顆粒，具有很好的病毒顆粒模擬功能，因此，在核酸提取過程中，與標本中真正病毒核酸的提取過程有很好的相似性。 此外，也有人應用牛腹瀉病毒（BVDV）作為檢測HCV的內部標準品15，或者用HCV病毒顆粒作為檢測HCV RNA的標準品代替WHO提供的HCV標準品16，或者用HIV病毒顆粒作為通用的病毒RNA標準品，但是，這些技術無法克服病毒顆粒傳染性、病毒顆粒制備運輸困難等問題，也就是說病毒顆粒不是理想的標準品。

10、 綜上所述，在RNA病毒的RT-PCR檢測中，影響實驗過程的因素較多，如實驗人員測定操作中的隨機誤差、擴增儀孔間溫度的差異、標本核酸提取后抑制物的殘留、待擴增靶核酸的濃度、逆轉錄的效率以及試劑的問題等，這些因素均可能會影響PCR擴增的效率，進而造成結果的偏差。因此，PCR測定必須使用質控品進行嚴格的室內質量控制才能保證結果的可靠性。此外，為進行定量測定，必須有定量的標準品或內標，內標還可以起到單管即時質控的作用。一個穩定可靠且無生物傳染危險性的RNA質控品和標準品，對于保證RNA病毒的RT-PCR檢測質量具有重要意義。在這一點上，裸露的RNA或病毒顆粒及病毒替代品均難以作為理想的質控品和標準品

11、，而采用分子克隆和原核表達方法構建的內含特定病毒RNA片段的噬菌體病毒樣顆粒則較好的解決了這些問題，其不但對于RNA病毒 RT-PCR檢測的標準化，而且對于特定的mRNA的檢測等均有著潛在的應用價值。 參考文獻 1Fronhoffs S, Totzke G, Stier S, et al. A method for the rapid construction of cRNA standard curves in quantitative real-time reverse tanscription polymerase chain reaction Mol Cell Probes, 2002

12、,16:99-110. 2Alms WJ, Braun-Elwert L, James SP, et al. Simultaneous quantitation of cytokine mRNAs by reverse transcription-polymerase chain reaction using multiple internal standard cRNAs. Diagn Mol Pathol, 1996.,5: 88-97. 3Kim K, Park J, Chung Y, et al. Use of internal standard RNA molecules for t

13、he RT-PCR amplification of the faeces-borne RNA viruses. J Virol Methods, 2002,104:107-115. 4Hazari S, Acharya SK, Panda SK. Development and evaluation of a quantitative competitive reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for hepatitis C virus RNA in serum using transcribed thio-RNA

14、 as internal control. J Virol Methods, 2004,116:45-54. 5Matthews JL, Chung M, Matyas RJ. Persistent DNA contamination in competitive RT-PCR using cRNA internal standards: identity, quantity, and control. Biotechniques, 2002,32:1412-1414, 1416-1417. 6Pickett GG, Peabody DS.Encapsidation of heterologo

15、us RNAs by bacteriophage MS2 coat protein. Nucleic Acids Res.,1993,21:4621-4626. 7Stockley PG, Stonehouse N J, Murray JB. et al. Probing sequence-specific RNA recognition by the bacteriophage MS2 coat protein. Nucleic Acids Res.,1995,23:2512-2518. 8Cartwright C. P. Synthetic Viral Particles Promise

16、to Be Valuable in the Standardization of Molecular Diagnostic Assays for Hepatitis C Virus. Clin Chem, 1999,45: 2057-2059. 9Cindy R, Peach W, Winkler M, et al. Ribonuclease-resisting RNA controls (armored RNA) for reverse transcription-PCR,branched DNA, and genotyping assays for hepatitis C virus. C

17、lin Chem,1999;45:2079-2085. 10Pasloske BL, Walkerpeach CR, Obermoeller RD, et al. Armored RNA technology for production of ribonuclease-resistant viral RNA controls and standards J Clin Microbiol, 1998,36:3590-3594. 11Drosten C, Seiferied E, Roth WK. TaqMan 5-nuclease human immunodeficiency virus ty

18、pe 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening. J Clin Microbiol, 2001,39:4302-4308. 12李金明，宋如俊，王露楠等。耐核糖核酸酶病毒樣顆粒的構建和表達. 中華檢驗醫學雜志, 2003,26:86-88. 13李金明，宋如俊，王露楠等。耐核糖核酸酶內含HCV RNA病毒樣顆粒的表達. 中華微生物學和免疫學雜志, 2003, 23：811-813. 15Shivprasad S, Pogue GP, Lewandowski DJ. et al. Heterologous sequences greatly affect foreign gene expression in tobacco mosaic virus-based vectors. Virology, 1999,255:312-323. 16Clela