1、1藥敏試驗的方法及耐藥菌株檢測藥敏試驗的方法及耐藥菌株檢測昆明市延安醫院檢驗科昆明市延安醫院檢驗科 黃云昆黃云昆2主要內容主要內容n抗菌藥物敏感性試驗的目的和方法抗菌藥物敏感性試驗的目的和方法n紙片擴散法藥敏試驗的標準化操作程序紙片擴散法藥敏試驗的標準化操作程序n臨床上重要的耐藥細菌及檢測方法臨床上重要的耐藥細菌及檢測方法3什么是抗菌藥物的敏感性試驗？什么是抗菌藥物的敏感性試驗？n測定抗菌藥物在體外抑制病原微生物生長的測定抗菌藥物在體外抑制病原微生物生長的效力，稱抗菌藥物對細菌的抑菌試驗，或稱效力，稱抗菌藥物對細菌的抑菌試驗，或稱細菌對藥物的敏感性試驗。細菌對藥物的敏感性試驗。4藥敏試驗的適應

2、征藥敏試驗的適應征n當某種細菌被認為是感染性疾病病原，需抗當某種細菌被認為是感染性疾病病原，需抗生素治療而該細菌的藥敏譜不能從其種屬推生素治療而該細菌的藥敏譜不能從其種屬推知時，即須做藥敏試驗知時，即須做藥敏試驗n正常菌群或已知目前對基本藥物尚未出現耐正常菌群或已知目前對基本藥物尚未出現耐藥株的細菌不需做藥敏試驗藥株的細菌不需做藥敏試驗.5藥敏試驗的目的和意義藥敏試驗的目的和意義n供臨床醫師選用抗菌藥物時的參考供臨床醫師選用抗菌藥物時的參考n細菌耐藥性監測和耐藥性變遷細菌耐藥性監測和耐藥性變遷n評價新抗菌藥物的藥效學特征評價新抗菌藥物的藥效學特征n對細菌耐藥譜分析和分型有助于某些菌種的對細菌耐

3、藥譜分析和分型有助于某些菌種的鑒定鑒定n作為醫院內感染流行病學調查的手段之一作為醫院內感染流行病學調查的手段之一6藥敏試驗的方法藥敏試驗的方法n稀釋法稀釋法n試管稀釋法（肉湯稀釋法）試管稀釋法（肉湯稀釋法）n平板稀釋法（瓊脂稀釋法）平板稀釋法（瓊脂稀釋法）n擴散法（紙片法）擴散法（紙片法）nKirby-Bauer(K-B)法法nStockes法法nE-Test(Epsilometer test) 7藥敏試驗的方法藥敏試驗的方法n自動微生物鑒定藥敏系統：結果為自動微生物鑒定藥敏系統：結果為MIC,ml。n耐藥篩選試驗和折點敏感試驗耐藥篩選試驗和折點敏感試驗 n聯合藥敏試驗聯合藥敏試驗:兩種藥物的

4、協同兩種藥物的協同,無關無關,拮抗關拮抗關系系.8稀釋法稀釋法原理：以一定濃度的抗菌藥物與含原理：以一定濃度的抗菌藥物與含有被測菌株的培養基進行一系列的有被測菌株的培養基進行一系列的對倍稀釋經培養后，肉眼觀察細菌對倍稀釋經培養后，肉眼觀察細菌生長的情況生長的情況最低抑菌濃度（最低抑菌濃度（MIC）：肉眼觀察）：肉眼觀察能抑制細菌生長的最低一管藥物濃能抑制細菌生長的最低一管藥物濃度（度（Minimal inhibitory concentration，MIC）瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法試管稀釋法試管稀釋法肉湯微量法肉湯微量法9紙片擴散法（紙片擴散法（Kirby-Bauer，K-B法）法） 10E-試驗

5、（試驗（E-Test）原理：基本同擴散法，即濃度呈連續梯度的抗菌藥物從塑原理：基本同擴散法，即濃度呈連續梯度的抗菌藥物從塑料紙條中向藥敏瓊脂中擴散，在試條周圍濃度范圍內檢測料紙條中向藥敏瓊脂中擴散，在試條周圍濃度范圍內檢測菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。 E-test綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點，直接定綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點，直接定量測出藥物對測試菌的最低抑菌濃度（量測出藥物對測試菌的最低抑菌濃度（MIC）。）。 菌液，藥敏平板要求同菌液，藥敏平板要求同K-B法法 E-Test條寬條寬5mm，長，長60mm 150mm平皿貼平皿貼6條、

6、條、 90mm平皿貼平皿貼1條條11CLSI的簡單介紹的簡單介紹n NCCLS （The National Committee for clinical laboratory Standards） 美國臨床實驗室標準委員會美國臨床實驗室標準委員會 已經被我國衛生部指定為部頒標準已經被我國衛生部指定為部頒標準 每年有新版每年有新版nCLSI （Clinical and Laboratory StandardsInstitute） 美國臨床實驗室標準化研究所美國臨床實驗室標準化研究所 2005年年12紙片擴散法藥敏試驗（紙片擴散法藥敏試驗（KB法）法）n原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有細菌的瓊脂

7、原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，因此敏感平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，因此敏感細菌在紙片周圍一定距離內的生長受到抑制，形成細菌在紙片周圍一定距離內的生長受到抑制，形成相應的抑菌圈，其大小與該藥物的最低抑菌濃度相應的抑菌圈，其大小與該藥物的最低抑菌濃度（MIC）呈負關，根據抑菌圈的大小即可推知該藥）呈負關，根據抑菌圈的大小即可推知該藥物的物的MIC，可將藥敏結果判斷為敏感、中介和耐藥。，可將藥敏結果判斷為敏感、中介和耐藥。13KB法藥敏法藥敏培養基培養基n腸桿菌科，銅綠假單胞菌、不動桿菌屬、嗜麥芽窄腸桿菌科，銅綠假單胞菌、不動桿菌屬、嗜麥芽窄

8、食單胞菌、洋蔥假單胞菌等非發酵菌食單胞菌、洋蔥假單胞菌等非發酵菌nMueller-Hinton （MH）瓊脂，）瓊脂，pH7.27.4，厚度，厚度4mmn葡萄球菌屬、腸球菌屬葡萄球菌屬、腸球菌屬nMueller-Hinton（MH）瓊脂）瓊脂n肺炎鏈球菌、肺炎鏈球菌、溶血鏈球菌、草綠鏈球菌、腦膜炎溶血鏈球菌、草綠鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌奈瑟菌n5%脫纖維羊血脫纖維羊血MH瓊脂瓊脂14KB法藥敏法藥敏培養基培養基n嗜血桿菌屬嗜血桿菌屬nHaemophilus Test Medium（HTM），添加），添加SR158或或1%血紅蛋白和血紅蛋白和1%X、V因子復合物因子復合物MHn淋病奈瑟球菌淋病奈瑟球

9、菌n1%血紅蛋白和血紅蛋白和1%X、V因子復合物的因子復合物的GC瓊脂瓊脂15操作程序操作程序n測試菌準備：所測菌種必須是純的、測試菌準備：所測菌種必須是純的、1624小時（對數生長期）培養物，不純菌種需首小時（對數生長期）培養物，不純菌種需首先分純，否則不得進行藥敏試驗。先分純，否則不得進行藥敏試驗。 16操作程序操作程序n菌液濃度制備菌液濃度制備n直接菌懸液法：挑取平皿上直接菌懸液法：挑取平皿上至少至少3個個已分純菌落于無菌生已分純菌落于無菌生理鹽水中，制備成理鹽水中，制備成0.5麥氏單位麥氏單位(McFarland)標準的菌懸標準的菌懸液液（1.5108CFU/ml），用，用0.5麥氏單

10、位標準比濁管或麥氏單位標準比濁管或比濁儀校正，制備好的菌懸液需比濁儀校正，制備好的菌懸液需15分鐘內接種完畢分鐘內接種完畢n生長法生長法 ：肉湯培養基增菌、校正濃度：肉湯培養基增菌、校正濃度17操作程序操作程序n0.5M標準比濁管的制作：標準比濁管的制作：0.5mL0.048mol/L的的Bacl2（1.175%w/v Bacl2H2O）+99.5mL0.18mol/LH2SO4 (1%v/v),混勻，分混勻，分裝，密封，每月更換或核實。確認方法：分裝，密封，每月更換或核實。確認方法：分光光度計光光度計d=1cm、=625nm，OD=0.080.10。18操作程序操作程序n接種菌液：接種菌液：

11、n用無菌且沒有毒性的棉簽蘸取菌液后，將棉簽在用無菌且沒有毒性的棉簽蘸取菌液后，將棉簽在管壁上輕輕旋轉擠壓幾次，去掉多余的菌液管壁上輕輕旋轉擠壓幾次，去掉多余的菌液n將蘸有菌液的棉簽置于瓊脂表面，從平皿最頂端將蘸有菌液的棉簽置于瓊脂表面，從平皿最頂端開始往外均勻涂布菌液至整個平皿，然后旋轉平開始往外均勻涂布菌液至整個平皿，然后旋轉平板板600 ，繼續從平皿頂端開始涂布，再重復，繼續從平皿頂端開始涂布，再重復2次次（共（共3次），最后沿平板邊緣涂抹一周。次），最后沿平板邊緣涂抹一周。19操作程序操作程序n貼抗菌藥物紙片：接種好菌液的平板置室溫貼抗菌藥物紙片：接種好菌液的平板置室溫干燥干燥35分鐘，

12、待平板上的水分被瓊脂完全分鐘，待平板上的水分被瓊脂完全吸收，用鑷子取紙片一張，貼在瓊脂平板表吸收，用鑷子取紙片一張，貼在瓊脂平板表面，輕壓使其貼平，貼好的紙片不可再拿起，面，輕壓使其貼平，貼好的紙片不可再拿起，因紙片中的藥物已擴散到培養基中。各紙片因紙片中的藥物已擴散到培養基中。各紙片中心相距中心相距24 mm，紙片距平板邊緣，紙片距平板邊緣15 mm。即直徑即直徑90mm平板每個平板每個5片片 20抗菌藥物紙片的貯存抗菌藥物紙片的貯存n藥敏紙片的貯存藥敏紙片的貯存n大量長期貯存大量長期貯存-200C以下以下n常規用量常規用量40C冰箱保存冰箱保存n使用前將貯存容器移至室溫平衡使用前將貯存容器

13、移至室溫平衡12小時，小時，避免開啟貯存容器時產生冷凝水。避免開啟貯存容器時產生冷凝水。21抗菌藥物的選擇：抗菌藥物的選擇：CLSI分組分組A組組一級試驗并常規報告的藥物一級試驗并常規報告的藥物B組組一級試驗有選擇報告的藥物一級試驗有選擇報告的藥物C組組補充試驗有選擇報告的藥物補充試驗有選擇報告的藥物U組組僅用于泌尿道的補充試驗的藥物僅用于泌尿道的補充試驗的藥物O組組對該組細菌有臨床適應證但一般不允許對該組細菌有臨床適應證但一般不允許常規試驗與報告的藥物常規試驗與報告的藥物Inv組組對該菌群做研究用且尚未經對該菌群做研究用且尚未經FDA批準的批準的藥物藥物2223操作程序操作程序n孵育：將貼好

14、紙片的藥敏平板放入培養箱內，孵育：將貼好紙片的藥敏平板放入培養箱內，平板在孵箱內最好單獨擺放，如疊放不得超平板在孵箱內最好單獨擺放，如疊放不得超過過2個。個。24操作程序操作程序n孵育孵育條件條件n腸桿菌科：腸桿菌科： 35 2 ，16-18hn銅綠：銅綠： 35 2 ，16-18h，囊性纖維化病人，囊性纖維化病人需延長至需延長至24hn不動桿菌、嗜麥芽、洋蔥：不動桿菌、嗜麥芽、洋蔥：20-24hn葡萄球菌：葡萄球菌：33-35 （不可（不可 35 )，金葡，金葡16-18h ,SCoN24h，OXA、MET、NAF、VAN、FOX24hn腸球菌：腸球菌： 35 2 ，16-18h，VAN 2

15、4h25操作程序操作程序孵育孵育條件條件n溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌腦膜炎溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌腦膜炎奈瑟菌奈瑟菌 35 2 、5%CO2n淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌 36 1 （不可（不可37 )、5%CO2 n溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、奈瑟菌屬溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、奈瑟菌屬20-24小時小時n流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌16-18小時小時26操作程序操作程序n抑菌環直徑（抑菌環直徑（mm）的測量：）的測量：n將藥敏平板倒置，在直射光下測量用精確度為將藥敏平板倒置，在直射光下測量用精確度為1 mm的游的游標卡尺測量抑菌環直徑。抑菌環的邊以肉眼見不到細菌標卡尺測量抑菌環直

16、徑。抑菌環的邊以肉眼見不到細菌生長為限。生長為限。n對鏈球菌、嗜血桿菌等因血平皿或特珠營養物質補充平對鏈球菌、嗜血桿菌等因血平皿或特珠營養物質補充平皿的影響，可將平皿蓋移去，在反射光下測量皿的影響，可將平皿蓋移去，在反射光下測量n對某些特殊的細菌和抗菌藥則需要用透射光，如量取苯對某些特殊的細菌和抗菌藥則需要用透射光，如量取苯唑西林或唑西林或Va對葡萄球菌的抑菌圈時，必須要觀察抑菌圈對葡萄球菌的抑菌圈時，必須要觀察抑菌圈內是否存在任何生長的菌落。內是否存在任何生長的菌落。27應注意溶血性細菌的結果閱讀應注意溶血性細菌的結果閱讀n鏈球菌鏈球菌 -溶血性鏈球菌溶血性鏈球菌 草綠色鏈球菌草綠色鏈球菌

17、肺炎鏈球菌等肺炎鏈球菌等 應忽略溶血圈，讀取生長完全被抑制處應忽略溶血圈，讀取生長完全被抑制處28應注意產色素細菌的結果閱讀應注意產色素細菌的結果閱讀n有些細菌會在生長過程中產生色素有些細菌會在生長過程中產生色素 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 黃桿菌黃桿菌 沙雷菌沙雷菌 應忽略色素分泌圈，讀取生長完全被抑制處應忽略色素分泌圈，讀取生長完全被抑制處29操作程序操作程序n對變形桿菌藥敏及磺胺藥產生的抑菌環內會對變形桿菌藥敏及磺胺藥產生的抑菌環內會出現輕微生長，如生長的菌膜厚度出現輕微生長，如生長的菌膜厚度20%可忽可忽略不計略不計 30操作程序操作程序n結果的判斷：按結果的判斷：按CLSI最新判斷標準

18、判斷為敏最新判斷標準判斷為敏感、中介或耐藥感、中介或耐藥 31臨床意義臨床意義n敏感（敏感（susceptible,S）：測試菌可被常規劑量、常）：測試菌可被常規劑量、常規給藥途徑在體內所能達到的血藥濃度所抑制或殺規給藥途徑在體內所能達到的血藥濃度所抑制或殺滅。滅。n中介中介(intermediate,I)：測試菌對常規劑量、常規給：測試菌對常規劑量、常規給藥途徑在體內所能達到的血藥濃度敏感性降低，加藥途徑在體內所能達到的血藥濃度敏感性降低，加大劑量、藥物濃集部位可能有效；實驗因素所致的大劑量、藥物濃集部位可能有效；實驗因素所致的不可判斷。不可判斷。n耐藥耐藥(resistance,R)：細菌

19、對藥物的相對抗性。：細菌對藥物的相對抗性。32藥敏報告中的注意事項藥敏報告中的注意事項n分離自腦脊液標本的細菌下列抗菌藥分離自腦脊液標本的細菌下列抗菌藥不能報告不能報告n口服藥口服藥n第一代、第二代頭孢菌素第一代、第二代頭孢菌素(除頭孢呋辛除頭孢呋辛)n克林霉素克林霉素n大環內酯類大環內酯類n四環類四環類n氟喹諾酮類氟喹諾酮類33藥敏報告中的注意事項藥敏報告中的注意事項n分離自尿液標本的細菌下列抗菌藥分離自尿液標本的細菌下列抗菌藥不常規報告不常規報告n阿奇霉素阿奇霉素n氯霉素氯霉素n克拉霉素克拉霉素n克林霉素克林霉素n紅霉素紅霉素34影響影響K-B法抑菌區大小的技術因素法抑菌區大小的技術因素n

20、接種密度：菌落接近融合生長為宜接種密度：菌落接近融合生長為宜n紙片放置時間紙片放置時間n孵育溫度孵育溫度n孵育時間孵育時間n培養皿的大小、培養基深度、抗菌藥物紙片間距培養皿的大小、培養基深度、抗菌藥物紙片間距n紙片中抗菌藥物的含量紙片中抗菌藥物的含量n培養基組分：培養基中細菌生長速度、藥物擴散速培養基組分：培養基中細菌生長速度、藥物擴散速度、藥物活性等因素均可影響抑菌區的大小。度、藥物活性等因素均可影響抑菌區的大小。35方法學評價方法學評價n優點優點n技術簡單、試劑量較低、不需特殊設備、易于由技術簡單、試劑量較低、不需特殊設備、易于由人判斷人判斷n抗菌藥物可自由選擇抗菌藥物可自由選擇n缺點缺點

21、n影響因素多，方法必須標準化和規范化影響因素多，方法必須標準化和規范化n不能定量不能定量n特殊耐藥菌不能檢測（如特殊耐藥菌不能檢測（如VISA和低水平和低水平VRE）36質量控制質量控制n質量控制的目的質量控制的目的n是保證檢驗結果的精確性、可靠性和可重復性，是保證檢驗結果的精確性、可靠性和可重復性，規范試驗中使用的各種試劑，規范操作者的操作規范試驗中使用的各種試劑，規范操作者的操作規程和對結果的判斷。規程和對結果的判斷。n質量控制的方法質量控制的方法n采用已知抗菌藥物敏感的標準菌株進行測試采用已知抗菌藥物敏感的標準菌株進行測試37質量控制質量控制n常用標準菌株常用標準菌株n大腸埃希氏菌大腸埃

22、希氏菌ATCC25922n金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌ATCC25923n銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌ATCC27853n大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌ATCC35218n肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌ATCC700603n糞腸球菌糞腸球菌ATCC2921238質控頻率質控頻率n日測試標準日測試標準n每日進行質控菌株每日進行質控菌株/特定抗菌藥物試驗時，特定抗菌藥物試驗時，20個個連續樣品中，測定值在預定值范圍外連續樣品中，測定值在預定值范圍外1次，即為次，即為95%可信。若可信。若1次則需查找誤差原因并予以糾次則需查找誤差原因并予以糾正正39質量控制質量控制n周測試標準周測試標準n連續連續30天測試質控菌株

23、天測試質控菌株/特定抗菌藥物，測定值特定抗菌藥物，測定值不在預定值范圍不在預定值范圍3次，可改為周測試，若次，可改為周測試，若3則則需查找原因需查找原因n在進行周測試時若出現一次不在預定值范圍，則在進行周測試時若出現一次不在預定值范圍，則需連續需連續5天測試，若均在預定值范圍內，可恢復天測試，若均在預定值范圍內，可恢復周測試，若有任何一次超出預定值，則需查找原周測試，若有任何一次超出預定值，則需查找原因，重新開始連續因，重新開始連續5天測試，日測試需進行到問天測試，日測試需進行到問題解決為止題解決為止40耐藥性的概念耐藥性的概念n細菌（真菌）對抗菌藥物的相對抗性細菌（真菌）對抗菌藥物的相對抗性

24、n固有耐藥（固有耐藥（intrinsic resistance,天然耐天然耐藥）藥）n獲得性耐藥獲得性耐藥(acquired resistance)n交叉耐藥交叉耐藥(cross resistance)n多重耐藥多重耐藥(multidrug resistance，MDR)41耐藥性監測的意義耐藥性監測的意義n拖延耐藥基因的出現拖延耐藥基因的出現n制止已出現耐藥基因的播散制止已出現耐藥基因的播散n耐藥基因和機制的推斷耐藥基因和機制的推斷n提高提高“醫院感染控制醫院感染控制”的質量的質量n耐藥監測是經驗用藥的基礎耐藥監測是經驗用藥的基礎42 - -內酰胺酶的檢測內酰胺酶的檢測n頭孢哨噻吩（頭孢哨噻

25、吩（Nitrocefin)法法n碘測定法碘測定法43 - -內酰胺酶陽性的臨床意義內酰胺酶陽性的臨床意義n預示嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和卡他莫拉預示嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和卡他莫拉菌對青霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥菌對青霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥n預示葡萄球菌、腸球菌對青霉素、氨芐預示葡萄球菌、腸球菌對青霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧芐西青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧芐西林、哌拉西林耐藥林、哌拉西林耐藥44革蘭陰性菌耐藥性的檢測革蘭陰性菌耐藥性的檢測n超廣譜超廣譜內酰胺酶（內酰胺酶（ESBLs） n染色體介導高產頭孢菌素酶（染色體介導高產頭孢菌素酶（AmpC酶）酶）n碳青霉烯酶碳青霉烯酶

26、 45ESBLsESBLs的分類的分類根據基因同源性不同分為：根據基因同源性不同分為：TEM型型 80SHV型型 46CTX-M型型 37OXA型型 18其它型其它型 20/studies/webt.htm.CTX-M-1組組CTX-M-2組組CTX-M-8組組CTX-M-9組組46ESBLsESBLs 的的 檢測檢測n單紙片篩選試驗單紙片篩選試驗n頭孢泊肟（頭孢泊肟（10g/片）片）17mmn頭孢他啶（頭孢他啶（30g/片）片）22mmn氨曲南（氨曲南（30g/片）片）27mmn頭孢噻肟（頭孢噻肟（30g/片）片）27mmn頭孢曲松（頭孢曲松（30g/片

27、）片）25mm47ESBLsESBLs 的的 檢測檢測n雙紙片協同實驗：雙紙片協同實驗：內酰胺酶抑制劑內酰胺酶抑制劑n確證試驗：確證試驗：n頭孢他啶頭孢他啶/克拉維酸（克拉維酸（30/10g/片）片） 頭孢頭孢他啶他啶5mmn頭孢噻肟頭孢噻肟/克拉維酸（克拉維酸（30/10g/片）片） 頭孢頭孢噻肟噻肟5mm48抑制劑增強的紙片擴散法抑制劑增強的紙片擴散法頭孢噻肟頭孢噻肟 克拉維酸克拉維酸頭孢噻肟頭孢噻肟頭孢他啶頭孢他啶頭孢他啶頭孢他啶 克拉維酸克拉維酸49ESBLs Detection Methods:InhibitionESBLs Detection Methods:Inhibition

28、by Clavulanic by Clavulanic Acid Acid Ronald J. Jones （Reprinted with Permission of Author）. ESBL Etest Prescribing Information AB BIODISK50ESBLsESBLs 的耐藥性的耐藥性 n所有青霉素類所有青霉素類n頭孢菌素類（頭孢菌素類（、代）代）n氨曲南氨曲南n如已使用如已使用CLSI2010新折點，以上頭孢菌素和新折點，以上頭孢菌素和氨曲南的檢測結果無需修正氨曲南的檢測結果無需修正51頭孢菌素酶頭孢菌素酶哪些細菌產生哪些細菌產生AmpC酶酶?n 腸桿菌屬（陰

29、溝、產氣）腸桿菌屬（陰溝、產氣）n 弗勞地枸櫞酸桿菌弗勞地枸櫞酸桿菌n 摩根摩根菌摩根摩根菌n 普魯菲登菌屬普魯菲登菌屬n 粘質沙雷菌等粘質沙雷菌等52n分子量大約為分子量大約為39000左右左右n等電點大多等電點大多9.0n能分解三代頭孢菌素及單環酰胺類抗生素能分解三代頭孢菌素及單環酰胺類抗生素n不被不被-內酰胺酶抑制劑所抑制，但可被氯唑西內酰胺酶抑制劑所抑制，但可被氯唑西林抑制林抑制頭孢菌素酶頭孢菌素酶53n低基礎水平持續表達低基礎水平持續表達n低基礎水平和高誘導產生低基礎水平和高誘導產生n高基礎水平持續表達：高基礎水平持續表達：AmpC調節調節基因突變基因突變表型分類表型分類5455Am

30、pC酶的檢測（三維試驗）酶的檢測（三維試驗） 酶的提取酶的提取 凍融法凍融法 超聲波破碎法超聲波破碎法 1個菌落個菌落 1個菌落個菌落 種入種入12ml大豆湯。大豆湯。35 0C震搖震搖4-6h 種入種入40ml大豆湯。大豆湯。35 0C震搖過夜震搖過夜 4 0C 40000rpm，離心，離心20min，去上清液，去上清液 4 0C 4000rpm，離心，離心20分鐘，去上清液分鐘，去上清液 沉淀物沉淀物-89 0C反復凍溶反復凍溶5次次 重懸在重懸在5mlpH7.0 的的.01MPBS中中加入加入1.5mlpH7.0的的0.01MPBS， 超聲波破碎超聲波破碎10秒，間隔秒，間隔15秒，重復

31、秒，重復 旋轉混勻。旋轉混勻。 10次次 4 0C 12,000轉轉rpm離心離心20分鐘分鐘 4 0C 12,000rpm離心離心20分鐘分鐘 取上清液，取上清液，-20 0C保存備用保存備用 取上清液，取上清液，-20 0C保存備用保存備用56- -內酰胺酶的檢測內酰胺酶的檢測CTX酶粗提液酶粗提液酶粗提液酶粗提液+克拉維酸克拉維酸酶粗提液酶粗提液+氯唑西林氯唑西林酶粗提液酶粗提液+克拉維酸克拉維酸+氯唑西林氯唑西林57產產AmpC酶菌株的耐藥性酶菌株的耐藥性n對下列藥物耐藥對下列藥物耐藥n頭霉素類（頭孢西丁、頭孢美唑）頭霉素類（頭孢西丁、頭孢美唑）n第三代頭孢菌素第三代頭孢菌素n酶抑制劑

32、復方制劑酶抑制劑復方制劑并可同時對氟喹酮類和氨基糖苷類耐藥并可同時對氟喹酮類和氨基糖苷類耐藥n對第四代頭孢菌素（頭孢吡肟）和碳青霉烯類敏感對第四代頭孢菌素（頭孢吡肟）和碳青霉烯類敏感n如為如為ESBLs+AmpC酶菌株第四代頭孢菌素亦耐藥酶菌株第四代頭孢菌素亦耐藥58n指所有能明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青指所有能明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類霉烯類抗生素的一類內酰胺酶內酰胺酶n分別屬于分別屬于Ambler分子分類中的分子分類中的A類、類、B類、類、D類酶類酶 。 碳青霉烯酶碳青霉烯酶 59n 天然來源碳青霉烯酶天然來源碳青霉烯酶 嗜麥芽寡養單胞菌的嗜麥芽寡養單胞菌的L1

33、酶酶n 獲得性碳青霉烯酶（獲得性碳青霉烯酶（Ambler分子分類）分子分類） B類類酶酶（金屬酶）：金屬酶）：IMP、VIM類及類及SPM-1 A類酶：類酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等等 D類酶：類酶：OXA-23至至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其來源可分為碳青霉烯酶按其來源可分為60IMP紙片EDTA2-巰基丙酸陽性對照株結果陽性對照株結果臨床標本結果臨床標本結果IMP紙片EDTA2-巰基丙酸金屬酶篩選結果金屬酶篩選結果61 2001年在美國北卡羅來納州首次報道年在美國北卡羅來納州首次報道 屬于屬于A類類2f組絲氨酸碳青霉烯酶組絲氨酸碳青霉烯酶-內內酰胺酶酰胺酶 水解

34、包括碳青霉烯類抗生素在內的所水解包括碳青霉烯類抗生素在內的所有有-內酰胺類抗生素內酰胺類抗生素,但對頭孢他啶和但對頭孢他啶和頭孢西丁相對較弱頭孢西丁相對較弱,不被不被EDTA抑制，加抑制，加Zn之后活性不增強之后活性不增強 酶抑制劑如克拉維酸有部分抑制作用酶抑制劑如克拉維酸有部分抑制作用 編碼基因位于質粒上編碼基因位于質粒上 肺炎克雷伯菌產生的碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌產生的碳青霉烯酶KPC（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase)62n肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌n其他腸桿菌科細菌：大腸埃希菌、產酸克其他腸桿菌科細菌：大腸埃希菌、產酸克雷伯菌、沙門菌、腸桿菌屬、黏質沙

35、雷雷伯菌、沙門菌、腸桿菌屬、黏質沙雷菌、弗勞地枸椽酸桿菌和奇異變形桿菌菌、弗勞地枸椽酸桿菌和奇異變形桿菌n銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌n惡臭假單胞菌惡臭假單胞菌產產KPC酶的菌株酶的菌株63產產KPC酶菌株的檢測酶菌株的檢測n 何時需進行何時需進行KPC酶的檢測酶的檢測n頭孢他啶頭孢他啶 Rn頭孢噻肟頭孢噻肟 Rn頭孢曲松頭孢曲松 Rn頭孢吡肟不定頭孢吡肟不定n厄他培南厄他培南 MIC2 g/ml 19-21mmn亞胺培南亞胺培南 MIC2-4 g/ml n美羅培南美羅培南 MIC2-4 g/ml 16-21mm注意：亞胺培南不用于篩選變形桿菌屬注意：亞胺培南不用于篩選變形桿菌屬/普羅威登菌屬普羅

36、威登菌屬/摩根菌屬，也不用于摩根菌屬，也不用于K-B法篩查（檢測性能差）法篩查（檢測性能差）64The modified Hodge test Mueller-Hinton agar plate was inoculated with a 1:10 dilution of a 0.5McFarland suspension of E. coli ATCC 25922 and streaked for confluent growth using a swab. A10-ug imipenem disk was placed in the center, and each test isolat

37、e was streaked from the disk to the edge of the plate. Isolate A is a KPC producer and positive by the modified Hodge test. IsolatesB, C, Dand E do not produce a carbapenemase and are negative by the test.K. F. Anderson, D. R. Lonsway, J. K. Rasheed，etal. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2007,

38、 p. 27232725Modified Hodge test65n單產單產KPC酶菌株表現只是對碳青霉烯類抗酶菌株表現只是對碳青霉烯類抗生素低度耐藥，合并膜孔蛋白缺失，高度耐生素低度耐藥，合并膜孔蛋白缺失，高度耐藥。藥。n可與其它質粒介導的耐藥基因同時存在，可與其它質粒介導的耐藥基因同時存在，如如qnr、OXA、ESBLs、AmpC、氨基糖、氨基糖苷甲基化酶基因等，可形成所有常規抗菌苷甲基化酶基因等，可形成所有常規抗菌藥物耐藥。藥物耐藥。產產KPC酶菌株的耐藥性酶菌株的耐藥性66關于碳青霉烯酶陽性但碳青霉烯類關于碳青霉烯酶陽性但碳青霉烯類“敏感敏感” 的菌株的菌株n對報告可作評論：對報告可作

39、評論：“這株細菌證實產碳青霉烯酶。碳青霉烯類對這株細菌證實產碳青霉烯酶。碳青霉烯類對處于敏感范圍處于敏感范圍(厄他培南厄他培南2 g/ml、亞胺培南、亞胺培南4 g/ml和和/或美羅培南或美羅培南4g/ml)的腸桿菌科的腸桿菌科細菌引起感染的臨床功能還未明。但是在體細菌引起感染的臨床功能還未明。但是在體外證實是碳青霉烯酶產生株外證實是碳青霉烯酶產生株”67n產產KPC酶菌株體外藥敏試驗可對所酶菌株體外藥敏試驗可對所有常用抗菌藥物耐藥，但對替加環素、有常用抗菌藥物耐藥，但對替加環素、多粘菌素多粘菌素B和多粘菌素和多粘菌素E敏感率較高，敏感率較高，在國外已用于治療在國外已用于治療n因為尿液中濃度低

40、，替加環素不推因為尿液中濃度低，替加環素不推薦用于治療尿道感染薦用于治療尿道感染產產KPC酶菌株的治療酶菌株的治療68革蘭陽性菌的耐藥性檢測革蘭陽性菌的耐藥性檢測nMRSA與與MRCoNSnVREnPRSPnVISA、hVISA與與VRSA69誘導性誘導性-內酰胺酶內酰胺酶70誘導性誘導性-內酰胺酶的檢測內酰胺酶的檢測71如何報告葡萄球菌屬青霉素結果如何報告葡萄球菌屬青霉素結果72MRSA的定義73MRSA的定義74 mecA-介導的金葡菌耐藥檢測方法比較介導的金葡菌耐藥檢測方法比較 敏感性敏感性:苯唑苯唑 MIC = 苯唑苯唑 紙片紙片 = 頭孢西丁紙片頭孢西丁紙片 = PBP2a = me

41、cA* 99% 98% 98% 100%特異性特異性:苯唑苯唑 MIC = 苯唑苯唑 紙片紙片 =頭孢西丁紙片頭孢西丁紙片 = PBP2a = mecA 100% 99% 100% 100%4775MRS的表型試驗的表型試驗 n 紙片擴散法紙片擴散法 用頭孢西丁用頭孢西丁 ( 30 g) 紙片紙片金葡菌金葡菌 其結果和苯唑西林紙片法一致其結果和苯唑西林紙片法一致（mecA金葡）金葡） CoNS 優于苯唑西林紙片法（已被取消）優于苯唑西林紙片法（已被取消） 結果清晰，讀起來比苯唑西林容易。結果清晰，讀起來比苯唑西林容易。 報告時仍報苯唑西林，而不是頭孢西丁報告時仍報苯唑西林，而不是頭孢西丁 MI

42、C試驗試驗 仍用苯唑西林藥仍用苯唑西林藥4376MRS的表型試驗的表型試驗頭孢西丁折點頭孢西丁折點 頭孢西丁抑菌圈頭孢西丁抑菌圈 (mm) Res Susc 金葡菌和金葡菌和 21* 22* 路登葡萄球菌路登葡萄球菌 CoNS 24* 25*報告苯唑西林耐藥報告苯唑西林耐藥* 報告苯唑西林敏感報告苯唑西林敏感 4477MRSA的檢測78針對CoNS的試驗規則改變79MRSA/MRSE的耐藥性的耐藥性n青霉素類青霉素類n頭孢菌素類頭孢菌素類n碳青霉烯類碳青霉烯類n含酶抑制劑的復方制劑含酶抑制劑的復方制劑均應報告耐藥，而不考慮其體外藥敏結果均應報告耐藥，而不考慮其體外藥敏結果80葡萄球菌葡萄球菌n

43、 “大環內脂類耐藥的葡萄球菌可以改變、誘導克林霉素耐藥大環內脂類耐藥的葡萄球菌可以改變、誘導克林霉素耐藥 n 由由erm基因導致基因導致 23S rRNA 甲基化耐藥，與大環內脂類甲基化耐藥，與大環內脂類, 林可林可霉素霉素, 和和 鏈陽霉素鏈陽霉素 B型有交叉，又叫型有交叉，又叫 MLSB 耐藥耐藥n 或只耐大環內脂類或只耐大環內脂類 (msrA 基因編碼的泵出機制基因編碼的泵出機制 ).”81機制機制基因基因紅霉素紅霉素克林霉素克林霉素泵出泵出msrARS改變核糖體改變核糖體(誘導誘導)ermRS*改變核糖體改變核糖體(結構結構)ermRR結構型結構型葡萄球菌葡萄球菌 紅霉素紅霉素 / 克

44、林霉素克林霉素82可誘導的克林霉素耐藥可誘導的克林霉素耐藥 (erm-介導介導)常規常規D試驗試驗: 陽性陽性 15 g 紅霉素紙片及紅霉素紙片及 2 g克林霉素之間距離為克林霉素之間距離為15-26.“D Test” 陽性反應陽性反應 83可誘導的克林霉素耐可誘導的克林霉素耐藥藥 (erm-介導介導)另一例子另一例子“D Test” 陽性陽性 反應反應84“D Test” 陰性陰性 反應反應無誘導無誘導(泵出泵出msrA-介導介導的紅霉素耐藥的紅霉素耐藥)85金葡菌金葡菌clindamycin R erythromycin R oxacillin R penicillin R vancomy

45、cin /“此此 金葡菌金葡菌 假定耐藥，因為查出誘導型的克林霉素耐藥假定耐藥，因為查出誘導型的克林霉素耐藥 . 但有些病人對克林霉素仍有效但有些病人對克林霉素仍有效.”“D Test” 陽性及評論陽性及評論86葡萄球菌對萬古霉素的藥敏試驗87葡萄球菌對萬古霉素的藥敏試驗88葡萄球菌對萬古霉素的藥敏試驗89hVISA的意義的意義nheterogenous vancomycin-intermediate resistance S. aureus (hVISA)which had been first reported by Hiramatsu et al in 1997.nhVISA strai

46、ns were reported from some Asiancountries. nThese various types of reduced susceptibility to vancomycin could lead to clinical failures of vancomycin treatment90hVISA的意義的意義91耐藥肺炎鏈球菌的檢測耐藥肺炎鏈球菌的檢測n耐藥肺炎鏈球菌耐藥肺炎鏈球菌:PNSP（PISP+PRSP）PNSP（腦膜炎標準）（腦膜炎標準）n對青霉素的對青霉素的MIC值值2.0g/ml=R,（PRSP）nMIC值在值在0.12g1.0g/ml之間的菌株

47、為相之間的菌株為相對耐藥（低耐）菌株（對耐藥（低耐）菌株（PISP）n MIC值值0.06g/ml=S92CLSI對肺炎鏈球菌性的對肺炎鏈球菌性的MIC折點折點注意：腦膜炎和非腦膜炎不同！注意：腦膜炎和非腦膜炎不同！93肺炎鏈球菌耐藥性的檢測肺炎鏈球菌耐藥性的檢測20 mm 報告青霉素敏感報告青霉素敏感青霉素的最低抑菌濃度青霉素的最低抑菌濃度=0.03mcg/ml19 mm 不能報告青霉素的結果，需進行不能報告青霉素的結果，需進行青霉素最小抑菌濃度的測試，因此時青毒素青霉素最小抑菌濃度的測試，因此時青毒素的結果可能為的結果可能為S、I或或R。青霉素的最低抑菌。青霉素的最低抑菌濃度濃度=1 mcg/ml；非腦膜炎型的感染敏感；非腦膜炎型的感染敏感（例如：肺炎）（例如：肺炎）苯唑西林紙片擴散法結果可提示肺炎鏈球菌對青霉素的敏感性苯唑西林紙片擴散法