1、蛋白質等電點測定及性質實驗一、目的：了解等電點的意義及其與蛋白質分子聚沉能力的關系。初步學會測定蛋白質等電點的基本方法，了解蛋白質的性質。二、原理：固體顆粒在液體中為什么能夠帶電？當固體與液體接觸時，固體可以從溶液中選擇性吸附某種離子，也可以是固體分子本身發(fā)生電離作用而使離子進入溶液，以致使固液兩相分別帶有不同符號的電荷，由于電中性的要求，帶電表面附近的液體中必有與固體表面電荷數(shù)量相等但符號相反的多余的反離子。在界面上帶電表面和反離子形成了雙電層的結構。 在兩種不同物質的界面上，正負電荷分別排列成的面層。 對于雙電層的具體結構，一百多年來不同學者提出了不同的看法。最早于1879年He

2、lmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了擴散雙電層模型；后來Stern又提出了Stern模型。根據(jù)O.斯特恩的觀點，一部分反離子由于電性吸引或非電性的特性吸引作用（例如范德華力）而和表面緊密結合，構成吸附層（或稱緊密層、斯特恩層）。其余的離子則擴散地分布在溶液中，構成雙電層的擴散層（或稱滑移面）。由于帶電表面的吸引作用，在擴散層中反離子的濃度遠大于同號離子。離表面越遠，過剩的反離子越少，直至在溶液內部反離子的濃度與同號離子相等。緊密層：溶液中反離子及溶劑分子受到足夠大的靜電力，范德華力或特性吸附力，而緊密吸附在固體表面上。其余反離子則構成

3、擴散層。滑動面：指固液兩相發(fā)生相對移動的界面，是凹凸不平的曲面。滑動面至溶液本體間的電勢差稱為電勢。固體顆粒帶電量的大小及測量方式？電勢只有在固液兩相發(fā)生相對移動時才能呈現(xiàn)出來。電勢的大小由Zeta電位表示，其數(shù)值的大小反映了膠粒帶電的程度，其數(shù)值越高表明膠粒帶電越多，擴散層越厚。一般來說，以pH值為橫坐標，Zeta電位為縱坐標作圖，Zeta電位為零對應的pH值即為等電點。對于蛋白質分子來說：蛋白質分子的大小在膠粒范圍內，約1100微米。大部分蛋白質分子的表面都有很多親水集團，這些集團以氫鍵形式與水分子進行水合作用，使水分子吸附在蛋白質分子表面而形成一層水合膜，具有親水性；又由于蛋白質分子表面

4、的親水集團都帶有電荷，會與極性水分子中的異性電荷吸引形成雙電層。而水合膜和雙電層的存在，使蛋白質的分子與分子之間不會相互凝聚，成為比較穩(wěn)定的膠體溶液。如果消除水合膜或雙電層其中一個因素，蛋白質溶液就會變得不穩(wěn)定，兩種因素都消除時，蛋白質分子就會互相凝聚成較大的分子而產(chǎn)生沉淀。在生活實踐中，常利用蛋白質的膠體性質沉淀或分離蛋白質。如做豆腐、肉皮凍就是利用蛋白質的膠凝作用。蛋白質分子所帶的電荷與溶液的pH值有很大關系，蛋白質是兩性電解質，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3+而帶正電，在堿性溶液中羧基形成-COO-而帶負電：蛋白質分子所帶凈電荷為零時的pH值稱為蛋白質的等電點（PI）。其定義為

5、：在某一pH的溶液中，蛋白質解離成陽離子和陰離子的趨勢或程度相等時，呈電中性，此時溶液的pH稱為該蛋白質的等電點。等電點的應用：主要用于蛋白質等兩性電解質的分離、提純和電泳。蛋白質等電點的測量方式：溶解度最低時的溶液pH。在等電點時，蛋白質分子在電場中不向任何一極移動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時可以使蛋白質溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。蛋白質在等電點時溶解度最小，最容易沉淀析出。蛋白質等電點的測定各種蛋白質的等電點都不相同，但偏酸性的較多，如牛乳中的酪蛋白的等電點是4.74.8，血紅蛋白等電點為6.76.8，胰島素是5.35.4，魚精蛋白是一個典型的堿性

6、蛋白，其等電點在pH 12.012.4。本實驗采用蛋白質在不同pH溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時的pH值即為該種蛋白質的等電點值，這個方法雖然不很準確，但在一般實驗條件下都能進行，操作也簡便。蛋白質的等電點比較準確的方法是采用等電聚焦技術加以準確測定，但需一定的實驗條件。等電聚焦電泳（IEF，isoelectric focusing electrophoresis）利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內制造一個pH梯度，電泳時每種蛋白質就將遷移到等于其等電點（pI）的pH處（此時此蛋白質不再帶有凈的正或負電荷），形成一個很窄的區(qū)帶。IEF的基本原理在IEF的

7、電泳中，具有pH梯度的介質其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等于聚焦蛋白質分子的等電點（pl）。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區(qū)帶。沉淀反應：蛋白質在某種理化條件下，蛋白膠體溶液的水化層或者電荷層破壞，蛋白膠體相互

8、聚集的現(xiàn)象。主要的沉淀現(xiàn)象有（1）鹽析：在蛋白質水溶液中加入足量的鹽類（如硫酸銨），可析出沉淀，稀釋后能溶解并仍保持原來的性質，不影響蛋白質的活性。這是一個可逆的過程，可用于蛋白質的分離與初級提純。（2）變性：在重金屬鹽、強酸、強堿、加熱、紫外線等作用下，引起蛋白質某些理性質改變和生物學功能喪失。這是一個不可逆過程。（3）加入一定量的溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質分子爭奪水分子，破壞水化膜，短時間內是可逆反應；（4）加入生物堿試劑（含氮的堿性物質）：能使生物堿沉淀或作用產(chǎn)生顏色反應的物質，稱為生物堿試劑。當溶液的pH小于PI時，蛋白質為陽離子，能與生物堿試劑的陰離子結合而生成沉淀。酪蛋白是牛奶

9、蛋白質的主要成分，常溫下在水中可溶解0.81.2%，微溶于25度水和有機溶劑，溶于稀堿和濃酸中，能吸收水分。當浸入水中則迅速膨脹。在牛奶中以磷酸二鈣、三鈣或兩者的復合物形式存在。構造極為復雜，沒有確定的分子式。分子量約為57000375000，在牛奶中約含3%，占牛奶蛋白質的80%。三、器材及試劑：1器材：試管1.5×厘米（×9）。吸管1毫升（×2），2毫升（×2），10毫升（×2）。容量瓶50毫升（×2），500毫升（×1）。試管架。2試劑：0.01mol·L-1醋酸溶液。0.1mol·L-1醋酸溶液。

10、1 mol·L-1醋酸溶液。1 mol·L-1氫氧化鈉溶液（氫氧化鈉和醋酸溶液的濃度要標定）。酪蛋白。四、操作步驟：1制備蛋白質膠液（1）稱取酪蛋白3克，放在燒杯中，加入40的蒸餾水。（2）加入50毫升1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，微熱攪拌直到蛋白質完全溶解為止。將溶解好的蛋白溶液轉移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸餾水洗凈燒杯，一并倒入容量瓶。（3）在容量瓶中再加入1 mol·L-1醋酸溶液50毫升，搖勻。（4）加入蒸餾水定容至500毫升，得到略現(xiàn)渾濁的，在0.1 mol·L-1NaAC溶液中的酪蛋白膠體。2等電點測定按下表順序在各管中加入

11、蛋白質膠液，并準確地加入蒸餾水和各種濃度的醋酸溶液，加入后立即搖勻。管號蛋白質膠液(毫升)H2O(毫升)0.01mol·L-1HAC(毫升)0.1mol·L-1HAC（毫升）1mol·L-1HAC（毫升）pH觀 察0分鐘10分鐘20分鐘1234567891111111118.387.758.758.508.007.005.001.007.400.621.250.250.501.002.004.008.001.605.95.65.35.04.74.44.13.83.5觀察各管產(chǎn)生的混濁并根據(jù)混濁度來判斷酪蛋白的等電點。觀察時可用+，+，+，表示渾濁度。3. 蛋白質性

12、質實驗（1）蛋白質的鹽析在試管里加入12毫升蛋白質的水溶液，然后逐滴加入硫酸銨飽和溶液，觀察現(xiàn)象，有無白色渾濁產(chǎn)生。滴加過程中不要搖動試管，現(xiàn)象不明顯時，多加幾滴硫酸銨飽和溶液。（2）蛋白質的變性在試管里加入2毫升蛋白質的水溶液，沸水浴加熱5分鐘，觀察現(xiàn)象。把試管里的下層物質取出一些放在水里，觀察現(xiàn)象。在試管里加入3毫升蛋白質的水溶液，加入1毫升硫酸銅溶液，觀察現(xiàn)象。（有無淡藍色絮狀渾濁沉淀產(chǎn)生）。把少量沉淀放入盛有蒸餾水的試管里，觀察沉淀是否溶解。五、思 考 題1、在等電點時蛋白質的溶解度為什么最低？請結合你的實驗結果和蛋白質的膠體性質加以說明。在等電點時，蛋白質分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時蛋白質分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物。2、本實驗中，酪