1、2021 呼吸道感染病原學診斷年度進展(全文)摘要呼吸道感染是人群的常見和高發疾病，嚴重時可發展為 ARDS 。各類病原 微生物如細菌、真菌、病毒，均可引起呼吸道感染，快速準確的病原檢測 是實現呼吸道感染疾病有效診治的關鍵， 但超過 50% 的患者未能診斷出明 確的致病微生物。近年來，以臨床宏基因組學、CRISPR (成簇規律間隔的短回文重復序列)為代表的新型檢測技術在病原診斷領域取得了迅速發 展，在提高病原檢出率的同時，也帶來了新的挑戰。本文綜述了過去 1 年 來呼吸道感染病原診斷領域的進展和成果，為呼吸道感染的病原診斷提供 臨床視角的思考。呼吸道感染可分為上呼吸道感染和下呼吸道感染。上呼吸

2、道感染包括普通 感冒、流行性感冒、鼻咽炎、扁桃腺炎、咽喉炎等。下呼吸道感染指的是 肺組織或者喉以下的氣管支氣管發生的感染，常由來自口腔和上呼吸道病 毒或細菌微生物向下呼吸道蔓延引起1。傳統的微生物培養和涂片依然是細菌和真菌診斷的“金標準” 2。近 10 年來，基于多重 PCR (polymerase chain reaction ， PCR)技術的多重 病原檢測技術得到了較快發展， 單次反應可以檢測 1030 種病原。自 2008年基于新一代測序技術(next gen erationseque ncing ， NGS)的臨床宏基因組學( metagenomics NGS ，mNGS )技術得到

3、了迅速發展和臨 床推廣，在少見 / 罕見病原及新發突發呼吸道傳染病病原鑒定方面取得了優 勢。新冠肺炎疫情的出現還促使基于CRISPR ( clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，成簇規律間隔的短回文重復序列)技術的病原檢測方法得到了美國食品藥品監督管理局( FDA )的授權 緊急使用。質譜直接用于臨床樣本中病原檢測已經取得了初步成果，在嚴 重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2 )檢測上已經過驗證。本文對過去

4、1 年內 ( 2020 年 10 月 1 日至 2021 年 9 月 30 日)國內外呼吸道感染病原學診 斷領域的重要研究進行回顧和綜述，啟發讀者今后對技術開發和臨床使用 進行思考。一、標本種類和質量對呼吸道病原檢測的影響 近年來，支氣管鏡技術在多種呼吸系統疾病的診斷和治療領域廣泛應用。 在重癥肺炎患者的臨床診斷中，支氣管鏡檢查表現出比 CT 檢查更好的敏 感度和特異度 3，支氣管鏡聯合快速現場評價 ( rapid on-site evaluationROSE)比單純支氣管鏡檢查首次檢查時間較長，但首次檢查未明確診斷 需選擇二次檢查的患者比例更低 4。支氣管鏡聯合 ROSE 可能提高了樣 本采

5、集質量進而提高了診斷率。肺泡 灌洗 液 多重 PCR 對 社 區獲 得 性肺炎 ( community-acquired pneumonia ，CAP ）患兒細菌檢出率高于痰培養和肺泡灌洗液培養 5，低灌注組患者（ 60 ml ）病原學檢測陽性率似乎高于高灌注組（ 120 ml ）， 但該研究樣本量偏低，結果還需要更大樣本量研究的驗證6 。除了肺泡灌洗液，唾液也可以作為呼吸道病毒檢測的候選樣本7。在對新冠肺炎住院患者的 183 份樣本進行數字 PCR 檢測發現，鼻咽拭子（ 28 份）的陽性率最高， 其次為唾液 （36 份），高于痰液（24 份），肛拭子（35 份）和糞便樣本 （ 14 份），且

6、唾液中病毒載量的中位數高于其他樣本 8； 另一項研究對 12 項唾液檢測 SARS-CoV-2 的研究進行薈萃分析， 結果顯 示唾液樣本檢測 SARS-CoV-2 的敏感度為 87% ，特異度為 98% 9。對 于其他病原，如流感病毒和肺炎鏈球菌等細菌病原體，唾液的的診斷意義 還需要進一步的研究。二、全自動集成式多重 PCR 技術的進展1. GeneXpert 快速診斷平臺： GeneXpert 平臺是一種能同時檢測 47 個靶點的自動化多重 PCR 平臺。 GeneXpert 結核分支桿菌檢測平臺在國 內應用較早，馮菁楠等 10 的 meta 分析顯示， GeneXpert 平臺對我 國人群

7、活動性肺結核檢測的敏感度為 94% ，特異度為 87% ；不同類型樣 本敏感度無明顯差異，但痰液的特異度高于支氣管灌洗液。對利福平耐藥 的肺結核敏感度為 92% ，特異度為 98% ，證明 GeneXpert 平臺在活動性 結核病診斷方面較好的臨床應用前景Xpert ?Xpress Flu/RSV 模塊可以同時檢測甲型流感病毒（ FluA ）、乙型流感病毒（FluB）和呼吸道合胞體病毒（RSV）等三種常見呼吸道病毒， 可在 30 min 內報告檢測結果，與一代測序方法具有很高的一致性： FluA 為 93.81% ， FluB 為 94.85% ， RSV 為 91.75% ，對三種病毒檢測的

8、敏感 度高于測序方法，但特異度略微低于測序的方法11 ；英國 642 例患者中的研究顯示該試劑盒對 FluA 的敏感度和特異性分別為 96.6% 和 98.1% ， 對 RSV 的敏感度為 86.0% 12。新冠肺炎疫情發生后，該試劑盒還加入 SARS-CoV-2 的檢測通道，使一次反應可檢測 4 種呼吸道病毒。2. FilmArray 巢式 PCR 系統： FilmArray 平臺整合了巢式 PCR 技術和微 流控芯片的技術優勢，其上呼吸道病原模塊（ respiratory Panel ）可在 1 次反應中檢測 16 種呼吸道病毒和 3 種非典型呼吸道病原體，在兒童呼吸 道 感染（ 鼻咽分

9、泌物 ， 鼻咽 拭子或痰標本 ） 中的病 原檢出率高達 84.83%86.88% 13, 14 ， FilmArray 組患者比對照組抗菌藥物使用更 少、住院時間更短 14 。盡管國內這些研究均顯示 FilmArray 平臺在呼 吸道病原檢出率上的優勢，但這些研究大部分為回顧性研究，缺乏嚴格的 對照組，對臨床診療效果的影響還需要前瞻性的隨機對照研究證實。Brotons 等15 前瞻性入組了 130 例重癥兒童患者同時進行 FilmArray 和傳統微生物檢測，在 FilmArray 檢測組中有 123 例（ 94.6% ）患者病原 陽性，而常規方法只在 87 例（ 66.9% ）患者中檢出病原

10、，但 FilmArray 細菌檢出人數低于培養的方法， 說明 FilmArray 的高檢出率主要是由于呼 吸道病毒檢出率高所致。 FilmArray 從樣本接收到報告的時間為 2.9 h， 65.4% 的患者可以在出 PICU 之前獲得病原檢測結果，而傳統方法這個比 例為 38.5% 。此外， FilmArray 平臺對 11 例( 8.4% )的抗菌藥物治療產 生了影響。該研究顯示出 FilmArray 平臺在兒童患者呼吸道病原快速診斷 和抗菌藥物合理應用方面的潛力，但該研究納入患者數目較少，不是隨機 雙盲實驗，影響了其證據等級 15 。 FilmArray 肺炎模塊( pneumonia

11、FilmArray )是 FilmArray 上呼吸道模塊的升級版本 16，將細菌病原 的檢測種類從 6 種提高到 18 種，使病原檢出率從原來的 40.5% 提高到 60.9% ，其中細菌病原檢出率從 66.4% 提高到 75.5% ，對 15 種細菌的檢 測敏感度為 75%100% ，特異度為 97%100% 16 。但細菌檢出率提 高對臨床抗菌藥物使用和臨床預后效果的影響需要進一步的研究 17。另外一種全自動多重 PCR 檢測系統 Unyvero 專注于呼吸道細菌和耐藥基 因檢測，可實現在 45 h 內同時檢測 21 種呼吸道細菌和 19 種耐藥基因， 在 84 份肺泡灌洗液的檢測中顯示

12、與培養方法82.1% 的一致性，但Unyvero 比培養方法檢測出了更多病原微生物( 38.1% vs 27.4% )和更 多的混合感染( 10.7% vs 2.4%) ，其總體敏感度和特異度分別為 84%和 98% 18。全自動多重 PCR 系統將檢測靶點提升至數十種，大大提高了 呼吸道感染病原學檢出率，但這類平臺檢測的病原種類大都在出廠時已固 定，臨床醫生無法根據患者臨床表現來選擇特定的組合，從而導致在只需 檢測部分靶點時也必須檢測組合中所有病原種類，導致醫療資源浪費。開 發可自由組合的模塊式自動化平臺是未來的一個發展方向 三、宏基因組病原檢測方法的進展和挑戰基于二代測序的 mNGS 方法

13、在近年來以醫學診斷服務的方式得到了較多 應用。該方法對樣本中所有微生物核酸進行測序和鑒定，理論上可一次性 檢測出樣本中所有致病微生物， 在病原檢出率上具有優勢 19, 20 。針對 PICU 患者的回顧性分析研究顯示， mNGS 病原檢出率高于培養，低于熒 光定量 PCR ( quantitative polymerase chain reaction， qPCR)，但該研究樣本量較少( 50 例) 21 。另一項研究入組了 99 例重癥兒童肺炎患 者， mNGS 對病原體(細菌 +病毒)檢出率為 97.8% ，而傳統方法(培養 +4 種呼吸道病毒 qPCR+ 肺炎支原體抗體檢測) 檢出率僅為

14、 66.7%22 。 mNGS 在檢測細菌和真菌方面優于傳統培養的方法( 95% vs 54%)，但 與 qPCR 方法相比，病毒檢出率要低 23 ；mNGS 方法可以檢出更多的 厭氧菌和苛氧菌， 這可能是 mNGS 方法細菌檢出率較高的原因之一 24 ； 相比較傳統微生物培養方法 25，三代 nanopore 測序的時效性更好， 最快可在 6 h 內報告結果。另一項國內多中心回顧性觀察研究納入了 159 例肺炎患者，采集患者的肺泡灌洗液進行傳統檢測和 mNGS 檢測。相比 較傳統培養 +涂片 +qPCR 的病原檢測方法， mNGS 檢出病原種類更多( 117 vs 72 )，其中 40.3%

15、 的患者根據 mNGS 結果調整了治療方案 26 。 但需要注意的是，這些研究未排除患者使用抗菌藥物的影響，這可能造成 了傳統方法細菌檢出率低于 mNGS 。在免疫抑制合并重癥肺炎患者的經驗 性抗菌藥物治療基礎上， 對肺泡灌洗液進行 mNGS 聯合質譜檢測病原學 并指導抗菌藥物使用，可以提升患者的治療效果，減少并發癥，但該研究 入組患者少(每組僅入組 25 例)，治療效果評價標準不明確 27 。整體 而言，國內大部分研究主要集中在單中心回顧性分析上，簡單的比較 mNGS 方法與傳統方法的敏感度、 特異度差異， 缺乏嚴格的隨機對照試驗， 大部分研究未能明確 mNSG 是否改善了患者的臨床預后。A

16、zar 等 28 回顧性分析了 30 例免疫抑制患者 mNGS 和傳統病原檢測 方法的報告結果， 針對 mNGS 報告的病原微生物， 2 名醫生根據既往文獻 報道、患者臨床癥狀、影像學和實驗室指標，分別獨立地判斷該病原是否 能解釋患者的臨床表現，結果顯示，在常規方法上加入 mNGS 檢測，可 以使病原檢出率從 35% 提高到 58% 。盡管該研究納入患者較少，但該研 究整合患者的臨床表現來判定病原的解釋程度，并采用兩位臨床醫生獨立 判斷的方式，其結果仍具備一定的參考意義。除了呼吸道樣本，體液中的無細胞 DNA (cell-free DNA ， cfDNA )也具 備病原檢測意義 29 。與金標

17、準相比， illumina 平臺 cfDNA 的檢測方法 針對細菌的敏感度和特異度分別為 79% 和 91% ，針對真菌敏感度和特異 度為 91% 和 89% ；在三代測序 nanopore 平臺上，針對細菌的敏感度 和特異度分別為 75% 和 81% ，針對真菌為 91% 和 100% 30 。該 研究顯示 cfDNA 作為 mNGS 檢測樣本的可行性，但另外一項研究納入 82 例兒童患者采用 mNGS 方法檢測血漿 cfDNA ，其結果顯示 cfDNA 的 mNGS 檢測對臨床影響有限 31 。 cfDNA 作為病原檢測靶點仍需更多的 研究支持 盡管 mNGS 技術在呼吸道感染病原檢測方面

18、已經取得了很大進展，但mNGS 方法檢測流程復雜， 對檢測試劑、 儀器運行環境及人員素質均有較 高的要求。檢測步驟涉及樣本核酸提取、文庫構建、生物信息學分析等多 個流程，所有過程必須嚴格質控才能確保最終結果的可靠性。此外，呼吸 道正常菌群的存在增加了 mNGS 報告的解釋難度；對于免疫抑制患者等 特殊人群，其致病微生物的判定標準應與免疫正常人群有所差異，建立特 殊人群特異性的病原數據庫和判定標準是一個可行的解決辦法。對于特殊 病原體， mNGS 方法也應該設置相應的樣本處理方法， 如厚壁微生物和結 核分枝桿菌等，這些病原破壁難度高，核酸提取效率低，可能會導致其檢 出率降低。針對不同患者人群不同

19、疾病癥候建立針對性的 mNGS 檢測流 程，是 mNGS 在臨床發揮更大效應的重要途徑。四、CRISPR 技術在呼吸道感染領域的應用CRISPR 技術是利用向導 RNA ( guide RNA )來引導 Cas 酶切割目標序 列的技術，特異度好，結合等溫擴增和試紙條顯色，無需復雜設備，可以 實現床旁檢測和野外檢測32 。CRISPR根據采用的Cas酶不同主要分 為 Cas13- 和 Cas12- 兩類，代表性方法分別是 SHERLOCK ( specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking )和 DETECTR( DNA endonu

20、clease targeted CRISPR trans reporter)33。 Joung 等34將 SHERLOCK 中原來的 Cas13 換成了 Cas12b ，利用環介導擴增，可以 實現在一管反應檢測 SARS-CoV-2 ，敏感度同 qPCR 方法相近。 在一項包括 378 例新冠肺炎患者的 SARS-CoV-2 檢測研究中， DETECTR 方法顯 示出和 qPCR 一樣的敏感度，并且能 100% 區分開其他冠病毒病毒型別 35 。美國 FDA 在 2021 年 1 月和 7 月分別批準了 SHERLOCK 和 DETECTR 在臨床 SARS-CoV-2 檢測上的緊急授權使用

21、36, 37 ，使得 CRISPR 檢測技術第一次從實驗室走向臨床。相比其他比較成熟的病原檢 測方法， CRISPR 技術在呼吸道病病原檢測方面還處于早期應用階段，其 可靠性和易用性還需要時間來證明。五、質譜在呼吸道病原快速診斷方面的潛力基質輔助激光解析電離飛行時間質譜( matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF-MS )在臨床微生物實驗室廣泛用于細菌和真菌培養物鑒定 38, 39 。新冠肺炎疫情 暴發后， MALDI-TOF-MS 被用于 SARS-CoV-2 的臨床檢測 40 ，在某 些疑似病例中表現出比 qPCR 更好的檢測效果 41 。但這些方法均需要 利用 PCR 的方法擴增病毒序列然后進行質譜分析，相比 qPCR 的方法