1、本科畢業論文題 目 鎂離子濃度對細胞融合效果的影響 學 院 生命科學學院 專 業 生物技術 畢業屆別 2012屆 姓 名 菲菲 指導教師 杰 職 稱 講師 目 錄摘要1關鍵詞1Abstract1Keywords1前言11材料與法21.1 實驗材料21.1.1試劑21.1.2 儀器21.2 實驗方法31.2.1 細胞的采取與細胞懸液的制備31.2.2 50%PEG的制31.2.3 細胞融合31.2.4 細胞融合率的計算方法31.2.5 細胞融合過程32 結果32.1 雞血細胞融合的過程的觀察42.2 在適宜條件下，不同鎂離子濃度對應不同細胞融合效率43討論和分析5 參考文獻5致67 / 9Mg2

2、+ 濃度對細胞融合效果的影響菲菲（農業大學生命科學學院生物制品專業，730070）摘要：細胞融合是細胞生物學領域近30年來得到迅速發展的一項新興技術手段，因其操作簡便、人工可控等優點在研究核質互作、腫瘤發生、疫苗研發和培育新型生物品種等方面均有廣泛應用。其中，利用聚乙二醇（PEG）進行化學融合是細胞融合中最為常用且簡便的技術手段。本文旨在為了更全面了解 PEG 法誘導的化學細胞融合，通過優化融合條件以提高化學細胞融合效率。以雞紅細胞為材料,以PEG(Mw= 6000)為誘導劑，研究Hanks溶液中不同的鎂離子濃度相對應的細胞融合率，確定細胞融合率適宜的鎂離子濃度圍。通過實驗確定鎂離子濃度在10

3、30 mmol/L圍類細胞融合率最大。關鍵詞：Mg2+；細胞融合；雞血紅細胞The Effect of Mg2+Concentration on Cell FusionZhangfeifei(College of life Science and Technology,Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)Abstract: Objective:cell fusion is the field of cell biology for nearly 30 years to get the rapid development of an eme

4、rging technology, because of its simple operation, the advantages of artificial controlled study Cytoplasmic, tumor, vaccine development and nurturing of new biological varieties terms are widely used. Among them, the use of polyethylene glycol (PEG) chemically fused cell fusion is the most commonly

5、 used and simple techniques. This article is intended for a more comprehensive understanding of PEG induced by chemical cell fusion, fusion by optimizing the conditions in order to improve the efficiency of chemical cell fusion. Methods: chicken erythrocytes as materials, PEG (Mw = 6000) as inducer,

6、 research Hanks solution in different concentration of magnesium ions corresponding cell fusion rate, determine the appropriate cell fusion rate of magnesium ion concentration range. The results show: the magnesium concentration in 10 30 mmol / L range largest class of cell fusion rate Key words: Mg

7、2+;ell fusion;Red blood cell前言細胞工程是四大生物工程之一，細胞融合技術作為細胞工程的一項核心基礎技術已在農業、醫藥、環保等領域取得了開創性的研究成果,而且應用領域不斷擴大。細胞融合技術的不斷改進一方面表現在融合劑上，另一方面體現在新方法上再者體現在融合對象的不斷擴展上1。所謂細胞融合(cell fusion)，就是在自發或人工誘導的條件下，兩個不同基因型的細胞或原生質體融合形成一個雜種細胞2。基本過程主要包括細胞融合形成異核體(heterokaryon)、異核體通過細胞有絲分裂進行核融合、最終形成單核的雜種細胞。細胞融合在植物育種方面已經成功的有蘿卜+甘藍、粉藍煙

8、草+郎氏煙草、番茄+馬鈴薯等等；在動物方面重要應用就是制備單克隆抗體。單克隆抗體可以用作診斷試劑，治療疾病和運載藥物，具有準確，高效，簡易，快速等優點，因此探究影響細胞融合的因素也已越來越重要。細胞融合依據融合過程采用的助融劑的不同可分為：（1）病毒誘導的細胞融合，如仙臺病毒；（2）學因子誘導的細胞融合，如聚乙二醇；（3）電場誘導的細胞融合,此外還有激光誘導的細胞融合3。其中 PEG 介導細胞融合法是動物細胞融合最簡單最常用的方法，具有操作簡便，不需復雜儀器，容易獲得融合，并且融合效果好等優點而被廣泛應用。PEG細胞融合法也有很多影響因素：如PEG分子量與濃度，PEG的PH值，融合時的溫度和P

9、EG的處理時間4等等。然而，目前關于PEG法誘導細胞融合的影響因素的研究還不夠全面，關于配方優化的詳細報道也不多，需要我們來做更多的實驗來研究。從離子濃度展開研究是提供細胞融合改進方案的新思路，具有很重要的意義。為此我們以雞紅血細胞為材料，探討了Mg2+濃度對細胞融合的影響，以期確定獲得較高細胞融合率的各項指標的數據圍，進一步擴寬PEG誘導細胞融合的應用圍。1材料與方法 1.1 實驗材料1.1.1 試劑公雞靜脈血，檸檬酸鈉，PEG（MW=6,000），MgSO4（國藥集團），0.85 %生理鹽水，Hanks溶液，Janus green B 染液（Solarbio 公司）。Hanks 緩沖液配方

10、： 甲液：NaCl 80.0 g ，KCl 4.0 g，MgSO47H2O 1.0 g，MgCl26H2O 1.0 g，蒸餾水400.0 mL，CaCl2（無水）1.4g，蒸餾水 50.0 mL將兩種液體混合后，加水至 500.0 mL，濾紙過濾，儲存于4.0 ； 乙液：Na2HPO412H2O 0.03g，KH2PO40.6 g，葡萄糖 10.0g，蒸餾水水400.0 mL，濾紙過濾，加入 0.5 % 酚紅 40.0 mL，加水至 500.0 mL，儲存于4.0 。 甲乙液各1 份，蒸餾水18 份，用 5.6 %NaHCO3調節 pH至 7.40。 1.1.2儀器 電子天平，恒溫水浴鍋，血球

11、計數板，低速離心機，光學顯微鏡，試管架，注射器，載玻片，離心管。1.2實驗方法1.2.1紅細胞的采取與細胞懸液的制備用滅菌的注射器吸入38 g/L的檸檬酸鈉2ml，從用75%酒精消過毒的雞翼靜脈處采取靜脈血轉入事先裝有38g/L的檸檬酸鈉的燒杯中使檸檬酸鈉與血液的體積比為1：4，放入4冰箱中保存，可使用3到4天。1.2.2 50%PEG的配制用MgSO4調節Hanks 溶液 Mg2+離子濃度分別為：10 mmol/L，20 mmol/L，30 mmol/L，40 mmol/L，50 mmol/L，60 mmol/L，70 mmol/L，80mmol/L，90mmol/L；Hanks 原液作為C

12、K對照管；共10種只有Mg2+含量不同的 Hanks緩沖液。稱取 1.0 g PEG （MW=6,000）放入試管，在酒精燈上融化，迅速加入 1.0 mL 預熱的 Hanks 緩沖液混勻制成 50 % PEG 溶液，放入 37 水浴中待用。1.2.3細胞融合 取新鮮雞血，1000rpm離心5min，去上清液后加入 0.85 %生理鹽水，用血球板計數法和梯度稀釋方法調節細胞濃度為 2.7105/ml；將雞紅細胞懸液 1.0 mL放入離心管中，分別加入5 mL上述10種 Hanks緩沖液液混勻，然后以1000 rpm離心5 min，棄上清，將細胞團塊彈散。然后分別滴加10種 50%PEG的細胞融合

13、液 1.0mL，混勻，37水浴中靜置 30 min 進行融合。融合完成后，緩慢滴加 5.0mL 相應 Hanks 緩沖液以終止 PEG 的作用，在37水浴靜置5分鐘。以 1000rpm，離心 5 min，棄上清，保留下液。1.2.4細胞融合率的計算方法隨機計數顯微鏡幾個視野1000個細胞,分別計數其中已發生融合的細胞核、未融合細胞核數,計算融合細胞核數占細胞核總數之百分比即融合率5,6,7。其公式如下:融合率=融合細胞核數/總細胞核數 100%1.2.5細胞融合過程 取細胞懸液12滴依次制成臨時制片，以Janus green B 染色3min，在普通光學顯微鏡下觀察細胞融合的過程8。2結果2.

14、1雞血細胞融合的過程的觀察通常細胞膜有外兩層，細胞融合首先發生在外層，然后再到層，由此就出現了兩種融合通道，細胞體物質通過這兩種通道轉移。在照片中的細胞形態是呈現有一個共同的膜包被，通過染液染色后，可以很清楚的看到兩個或多個細胞核存在于一個細胞類的現象，通過圖1可以看到不同實驗組融合結果的顯微鏡照片。另外，可以看到在鎂離子濃度在80 mmol/L的時候，通過觀察，細胞皺縮，細胞質也出現著色，出現死亡的現象。2.2在適宜條件下，不同鎂離子細胞濃度對應不同細胞融合速率通過顯微鏡的觀察，我們可以清清楚楚的看到染色后細胞融合的現象，并且它們融合個數依次減小，通過可以圖1看到。由表1可知，可以確定在鎂離

15、子濃度在10 mmol/L30 mmol/L圍類細胞融合效率最大，融合效果最好。表1不同Mg2+濃度對細胞融合效果的影響Table1:The effect of Mg2+concentration on cell fusionMg2+mmol/LCk102030405060708090融合率%15222017974211圖1細胞融合鏡檢，放大倍數100Fig1: Microscopy of Cell fusion，Magnification 100Note: A. Hanks (CK)；B. 10 mmol/L Mg2+；C. 20 mmol/L Mg2+；D. 50 mmol/L Mg2+；

16、E. 80 mmol/L Mg2+3討論和分析細胞融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠緣物種間的遺傳物質交換提供了有效途徑，這對于種質資源的開發和利用具有深遠的意義。聚乙二醇(PEG)是目前應用最為廣泛的細胞融合誘導物,其誘導細胞融合的效果穩定，它的作用機理是對水有極高的親和性，可與水分子借氫鍵結合，在高濃度（50%）PEG溶液中自由水消失，導致細胞脫水發生質膜結構的變化，從而引起細胞脫水9。活細胞是一個完整的滲透系統，當細胞處于不同濃度的溶液中時,必定會發生不同的變化，因此我們通過PEG介導的細胞融合，改變其鎂離子濃度來更好的完善細胞融合效率。在實驗中，我們可以觀察和CK組

17、對照，鎂離子濃度越大，細胞融合的也越來也少，呈梯度變化，并且在10 mmol/L30 mmol/L圍類，細胞融合最多，且數量最大。由于Mg2+濃度對于細胞融合效果的影響目前尚未有報道，關于 Ca2+濃度對于細胞融合的影響，哲等證實50 mmoL/L的 Ca2+濃度可以有效促進細胞融合，并在實驗中指出 100 mmol /L的 Ca2+會導致細胞破裂，我們在實驗中發現 Mg2+的濃度為80 mmol /L時細胞表現為皺縮變形，死亡數量增加，表現為細胞質Janus greenB 染液著色10。綜合分析，PEG法誘導細胞融合以其容易制備、活性穩定、不需要特別的儀器設備、操作方便等優點，被普遍用于生物

18、、遺傳、醫藥等研究領域11,12。因此，對PEG介導細胞融合的最適條件探究顯得尤為必要。鎂離子濃度對細胞融合能產生影響，在實驗中我們需要調節鎂離子濃度為10 mmol/L30 mmol/L圍類，可以促進細胞的融合。另外，細胞融合的影響因素還有很多，如PH、溫度、葡萄糖、稀釋的細胞濃度等。魯云風等13對于蟾蜍的實驗發現，蟾蜍血紅細胞最適融合溫度與雞血紅細胞最適融合溫度的不同可能是分別為冷血動物和恒溫動物導致的。隨著科技的發展，細胞融合會有更大的突破，更大的應用，未來科學家會將細胞融合的效率會提高的更好，研究更徹底，使其日益完善，為社會做出貢獻。PEG介導的細胞融合會更好，畢竟PEG法以便宜的價格

19、和高的細胞融合率被廣泛應用。因此，PEG化學融合法也在未來不斷被涉與其他方面的研究，更好的提高細胞融合率，也是細胞融合發展的一個新方向，一個為社會更好的研究。參考文獻1羅立新.細胞融合技術與應用M.:化學工業,2003:1-12小玉,胡火珍,建國.用雞紅細胞取代 Hela 細胞進行細胞融合的實驗研究J. 解剖學雜志, 2002, 10(3): 132-1333彥禹,艷華,照軍.雞紅細胞融合最適條件的探討J.生物磁學, 2006, 6 (1): 43-444仇燕,朝煒,苗芳. 聚乙二醇誘導雞紅細胞融合條件的優化J.生物技術, 2011, 21(3): 50-535玲,雪峰.細胞生物學實驗M.一版

20、.科學技術,2003:114-1166王金發,何炎明細胞生物學實驗教程：科學2011:150-1527玟.細胞融合實驗方法的改進J .大學醫學院學報第18卷第3期8耿欣蓮,丁克忠,全允栩,昭雪,邱山聚乙二醇(PEG)誘導雞紅血細胞和小白鼠腹水型肝癌細胞融合技術的初步探討J大學學報(自然科學版)1982:18(3):81-809 Kugler A, Stuhler G, Walden P. Rrgression of human metastatictenal cellcarcinoma after vaccinated with tumor cell-dendritic cellhybrids

21、J. Nat Med, 2000, 6: 33210.明軒,游孟昊,王美文,黃文君等葡萄糖濃度對細胞融合效果的影響J現代生物醫學進展 2014,17:00911Steubing RW,Cheng S，Numajir I Y，et al Laser Induced Cell Fusion in Combination With Optical TweezersJ.TheLaser Cell Fusion Trap Cytometry，1991，12: 505 -51012魯云風,柯金,建偉等. 蟾蜍紅細胞融合條件的正交設計優化J. 生物技術，2009，19(6)：44-45致 轉眼間，我已在農業大學度度過了四個年頭