1、第十三章PC*酸擴(kuò)增儀一、名詞解釋1 . PC叱術(shù)：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。2 . TaqDNA聚合酶：存在于水生嗜熱菌的嗜熱 DNA聚合酶，可在74c復(fù)制DNA, 在95 c仍具有酶活力。3 .水浴鍋PC電酸擴(kuò)增儀：屬于第一代PCR6因擴(kuò)增儀，以不同溫度的水浴鍋串聯(lián) 成一個(gè)控溫體系。4 .壓縮機(jī)PC電酸擴(kuò)增儀：于第二代PCR8因擴(kuò)增儀，由壓縮機(jī)自動(dòng)控溫，金屬導(dǎo) 熱。5.Overshooting升溫過程中，由于一些加熱元件，比如半導(dǎo)體、金屬塊上積蓄的 能量仍然會(huì)傳給PC咻系，造成實(shí)際的溫度高于設(shè)定的溫度，即overshooting現(xiàn) 象。6.Undershooting：在降

2、溫過程中也會(huì)出現(xiàn)慣性，造成實(shí)際的溫度短時(shí)間內(nèi)會(huì)低于 設(shè)定溫度。7.半導(dǎo)體PC戒酸擴(kuò)增儀：屬于第三代PCRS因擴(kuò)增儀，由半導(dǎo)體自動(dòng)控溫，金屬 導(dǎo)熱。8 .離心式空氣加熱PCFT增儀：屬于第三代PCRS因擴(kuò)增儀，由金屬線圈加熱，采 用空氣作為導(dǎo)熱媒介。9 .梯度PCRR：帶梯度PC劭能的基因擴(kuò)增儀，在反應(yīng)過程中每個(gè)孔的溫度控制條 件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng) 條件。io原位pcra：帶原位擴(kuò)增功能的基因擴(kuò)增儀。11 .原位PC叱術(shù)：即在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行PCFT增，組織細(xì)胞的形態(tài)不被破壞，是原 位雜交與PC敬術(shù)結(jié)合而形成的新技術(shù)。12 .熒光實(shí)時(shí)定量PCFRfc術(shù)

3、：在PC©應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針， 通過 檢測熒光信號，實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PC©應(yīng)過程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定 量分析。13 .位置的邊緣效應(yīng)：指PCW因擴(kuò)增儀最外周的樣品孔溫度與中間的樣品孔差異，不均一，從而導(dǎo)致外周樣品孔的 PCRT增效率不佳。14 .模塊溫控模式：儀器根據(jù)探測器直接探測的承載樣品金屬基座溫度進(jìn)行控制， 該模式適用于長時(shí)間的靜態(tài)孵育。15 .反應(yīng)管溫控模式：儀器根據(jù)探測器所探到的溫控模塊的溫度由計(jì)算機(jī)計(jì)算出 樣品管內(nèi)或PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來進(jìn)行控制。16 .Ct化 C代表cycle,t代表threshold。值的含義是，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的

4、熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，每個(gè)模板的 Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。二、選擇題【A型題】在五個(gè)選項(xiàng)中選出一個(gè)最佳答案。1 .以下哪種物質(zhì)在PCRK應(yīng)中不需要（D）A.Taq DN摩合酶B.dNTPsC.Mg2+D.RNA酶E合適PH緩沖液2 .以下哪種酶可耐高溫（A）A.Taq DNA1合酶B.HindiiiC.T4連接酶D.RNA酶E.Klenow 片段3 .PCRS應(yīng)的正確過程應(yīng)為（B）A.退火一變性一延伸B.變性一退火一延伸C退火一延伸一變性D.變性一延伸一退火E延伸一變性一退火4.PC叱術(shù)的本質(zhì)是（C）A.核酸雜交技術(shù)B.核酸重

5、組技術(shù)C核酸擴(kuò)增技術(shù)D.核酸變性技術(shù)E核酸連接技術(shù)1. TaqDNA聚合酶促反應(yīng)最適溫度（C） A.37B.5055 cC.7075cD.8085 c E.9495 c2.溫度均一性較好的PCR儀為（E）A.水浴鍋PCR核酸擴(kuò)增儀和壓縮機(jī)PC*酸擴(kuò)增儀B.半導(dǎo)體PCR核酸擴(kuò)增儀和離心式空氣加熱 PCRI（酸擴(kuò)增儀 C.壓縮機(jī)PCR核酸擴(kuò)增儀和半導(dǎo)體PC*酸擴(kuò)增儀D.壓縮機(jī)PCR核酸擴(kuò)增儀和離心式空氣加熱 PCRg（酸擴(kuò)增儀 E.水浴鍋PCR核酸擴(kuò)增儀和離心式空氣加熱 PCRI（酸擴(kuò)增儀 3. 一步就可以摸索出最適合反應(yīng)條件的 PCR儀為（B） A.普通PCR儀B.梯度PCR儀C.原位PCR儀D

6、.熒光PCR儀E.實(shí)時(shí)PCR儀4.能在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行PCR儀擴(kuò)增的PCR儀為（C）A.普通PCR儀B.梯度PCR儀C.原位PCR儀D.熒光PCR儀E.實(shí)時(shí)PCR儀5. PC叱術(shù)擴(kuò)增DNA,需要的條件是（A）目的基因；引物；四種脫氧核甘酸；DNA聚合酶等；mRNA核糖 體A.B.C.D.E.1. PCRg在引物、模板和4種脫氧核糖核甘酸存在的條件下依賴于 DNA聚合酶 的酶促合成反應(yīng)，其特異性決定因素為（B）A.模板B.引物C. dNTPD.鎂離子E. PH緩沖液2 .下述哪種PCR儀擴(kuò)增樣品可以了解樣品中 DNA原始拷貝數(shù)（D）A.普通PCR儀B.梯度PCR儀C.原位PCR儀D.熒光實(shí)時(shí)PCR儀E

7、.定性PCR儀3 .以下是經(jīng)過PCR擴(kuò)增后彳#到的Ct值，哪個(gè)樣品的DNA原始拷貝數(shù)最多（A）A.樣品 A, Ct=20B.樣品 A, Ct=22C.樣品 A, Ct=24D.樣品 A, Ct=26E樣品 A, Ct=2813.以空氣為加熱介質(zhì)的PCR儀是（C）A.金屬板實(shí)時(shí)定量PCR儀B.96孔板式實(shí)時(shí)定量PCR儀C離心式實(shí)時(shí)定量 PCR（文D.各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀E.熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀14 .下述哪個(gè)PCRT增儀可能具有多色多通道檢測系統(tǒng)（D）A.普通PCR儀B.梯度PCR儀C原位PCR儀D.熒光定量PCRaE定性PCR儀15 .下述哪個(gè)PCRT增儀對溫度控制要求最高（B）A.普通

8、PCR儀B.梯度PCR儀C原位PCR儀D.熒光定量PCRaE定性PCR儀16 .控溫精度最高的控溫方式是（D）A.水浴鍋控溫B.壓縮機(jī)控溫C半導(dǎo)體控溫D.離心式空氣加熱控溫E都一樣17 .在PCRT增過程中，下列哪個(gè)步驟對溫度精度要求最高（B）A.變性B退火C延伸D.退火和變性E都一樣18 .在PCRT增過程中，用同樣的樣品，同樣的 PCR反應(yīng)程序，同一個(gè)PCR儀, 最后的結(jié)果差異非常明顯，其可能的原因是下列哪個(gè)（B）A.溫度的準(zhǔn)確性差B.溫度的均一性差C升降溫的速度低D.不同模式下的相同溫度特性差E.熱蓋溫度不準(zhǔn)19 .PCR®酸擴(kuò)增儀最關(guān)鍵的部分是（A）A.溫度控制系統(tǒng)B.熒光檢

9、測系統(tǒng)C軟件系統(tǒng)D熱蓋E.樣品基座20 .“位置的邊緣效應(yīng)”是指（D）A.溫度的準(zhǔn)確性欠佳B.溫度的均一性欠佳C邊緣升降溫速度快D.邊緣升降溫速度慢E.梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式溫度不一致21 .PCRT增儀升降溫速度快有很多優(yōu)點(diǎn)，下述哪一項(xiàng)應(yīng)除外（C）A.縮短反應(yīng)時(shí)間B.提高工作效率C消除位置的邊緣效應(yīng)D.縮短非特異性反應(yīng)時(shí)間E提高反應(yīng)特異性22 .在梯度模式下得出最佳反應(yīng)條件，并以此條件在標(biāo)準(zhǔn)模式下單獨(dú)做，但結(jié)果 卻不如人意，最有可能的原因是（EA.樣品孔溫度與設(shè)定溫度不一致B.樣品孔之間的溫度有差異C.樣品孔位置的邊緣效應(yīng)較高D.升降溫速度不夠快E不同模式溫度特性有差異23 .定量PCRT增儀的

10、關(guān)機(jī)次序一般為（AA.關(guān)軟件一關(guān)PCR儀一關(guān)電腦B.關(guān)軟件一關(guān)電腦一關(guān)PCR儀C關(guān)PCR關(guān)一關(guān)軟件一關(guān)電腦D.關(guān)PCR關(guān)電腦一關(guān)軟件E關(guān)電腦一關(guān)PCR儀一關(guān)軟件【X型題】每題的備選答案中有兩個(gè)或兩個(gè)以上正確答案。1. PC叱術(shù)每一個(gè)循環(huán)均包含以下哪些環(huán)節(jié)（BCD）A.酶切B.變性C.退火D.延伸E.連接2 .以下哪些酶可用于PCR反應(yīng)（AC）A. KlenowB. HindiiiC. Taq DN咪合酶D. RNaseE. DNase3 .目前常用的PCR核酸擴(kuò)增儀控溫方式有（CD）A.水浴鍋控溫B.壓縮機(jī)控溫C.半導(dǎo)體控溫D.離心式空氣控溫E.金屬控溫4 .普通PCR核酸擴(kuò)增儀除通常的定性

11、PCRtZ外，還包括（ABCDEA.水浴式PCR儀B.梯度PCR儀C.原位PCR儀D.變溫金屬塊式PCR儀E.變溫氣流式PCR儀5.按變溫方式不同，PCR核酸擴(kuò)增儀可分為（ADE）A.水浴式PCR儀B.梯度PCR儀C.原位PCR儀D.變溫金屬塊式PCR儀E.變溫氣流式PCR儀6 .目前市場上實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀一般有哪些類別（ADE）A.金屬板實(shí)時(shí)定量PCR儀B.梯度定量PCR儀C.原位定量PCR儀D.離心式實(shí)時(shí)定量 PCR儀E.各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀7 .下述產(chǎn)品哪些屬于金屬板實(shí)時(shí)定量 PCR儀（BCDA. Light CycldM 熒光定量 PCR儀B. ABI 7500熒光定量 PC

12、RZC. MJ公司Chromo 4熒光定量PC敬D. Bio-rad公司iCycler熒光定量PCR儀E. Rotor-Gene 3000熒光定量 PCRft8 .下述產(chǎn)品哪些屬于離心式實(shí)時(shí)定量 PCR儀（AE）A.Light CycldM 熒光定量 PCRtZB.ABI 7500熒光定量PC敬C.MJ公司Chromo 4熒光定量PCR儀D.Biorad公司iCycler熒光定量PCR儀E.Rotor-Gene 3000熒光定量 PCR儀9 .PC*酸擴(kuò)增儀的溫度控制主要是指（ABD）A.溫度的準(zhǔn)確性控制B.溫度的均一性控制C退火溫度控制D.升降溫速度控制E延伸溫度控制10 .熒光定量PCR儀

13、的熒光檢測系統(tǒng)主要包括（B。A.發(fā)光二極管B.激發(fā)光源C.檢測器D.光度計(jì)E.光電倍增管11 .熒光定量PCR儀的熒光強(qiáng)度減弱或不穩(wěn)定，可能的原因有（ABE）A.濾光片發(fā)霉B.光源損耗C半導(dǎo)體模塊故障D.熒光染料污染E.光電倍增管靈敏度下降三、簡答題1 .什么是聚合酶反應(yīng)（PCR技術(shù)？PC岐術(shù)的本質(zhì)是核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過加熱使雙鏈DNA單開螺旋，在退火溫度條件 下引物同模板DN煤交，在Taq DNAK合酶，dNTPs Mg2利合適pHg沖液存在條 件下延伸引物，重復(fù)上述“變性一退火一引物延伸”過程至 25-40個(gè)循環(huán)，呈指 數(shù)級擴(kuò)大待測樣本中的核酸拷貝數(shù)，可以在體外對目的核酸進(jìn)行大量復(fù)制。2 .

14、 PCRK酸擴(kuò)增儀的工作關(guān)鍵是什么？經(jīng)歷了怎樣一個(gè)發(fā)展過程？PCR8因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制。其發(fā)展過程為：水浴鍋PC取屬于第一代PCR 基因擴(kuò)增儀，以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個(gè)控溫體系；壓縮機(jī)PC敢屬于第二代PCR6因擴(kuò)增儀，由壓縮機(jī)自動(dòng)控溫，金屬導(dǎo)熱，控溫較第一代PCRS因擴(kuò)增儀 方便；半導(dǎo)體PCRUS于第三代PCR6因擴(kuò)增儀，由半導(dǎo)體自動(dòng)控溫，金屬導(dǎo)熱， 控溫方便，體積小，相對穩(wěn)定性好；離心式空氣加熱PC敢屬于第三代PCR8因擴(kuò) 增儀，由金屬線圈加熱，采用空氣作為導(dǎo)熱媒介，溫度均一性好，各孔擴(kuò)增效率 高度一致。3 . PCRK酸擴(kuò)增儀按照變溫方式的不同可分為哪幾類？分別有什么特點(diǎn)。PC

15、國因擴(kuò)增儀按照變溫方式通常有以下三類：(1)水浴式PC敢：變溫快、時(shí)間準(zhǔn)、溫度均一，但體積大，自動(dòng)化程度不高。(2)變溫金屬塊式PCFT 通過半導(dǎo)體加熱和冷卻，并由微機(jī)控制恒溫和冷熱處 理過程。裝置比較牢固耐用，溫度變換平穩(wěn)，有利于保持Taq DNA5合酶的活性。(3)變溫氣流式PC敢：以空氣作為熱傳播媒介，由大功率風(fēng)扇及制冷設(shè)備提供 外部冷空氣而制冷。成本較低；安全程度高。微機(jī)配上軟件，可靈活編程。4 .什么是梯度PCR儀？它有什么優(yōu)點(diǎn)？梯度PCRZ是由普通PCRZ衍生出的帶梯度PC電能的基因擴(kuò)增儀。在反應(yīng)過 程中每個(gè)孔的溫 度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步 就可以摸索

16、出最適合的反應(yīng)條件。使用梯度 PCRX,多次實(shí)驗(yàn)可在一臺(tái)儀器上完 成，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，又節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。5 .何謂熒光實(shí)時(shí)定量 PCR (RQ-PCFR技術(shù)？熒光實(shí)時(shí)定量 PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR )技術(shù)即在 PC網(wǎng)應(yīng) 體系中加入特異 性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實(shí)的反映了體系中 模板的增加，通過檢測熒光信號，從而實(shí)時(shí) 監(jiān)測整個(gè)PCRJ應(yīng)過程，最后通過 標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析。6 .熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀有哪些種類，各有什么特點(diǎn)？ 目前市場上實(shí)時(shí)熒光定量PC©一般可分三類。(1)金屬板式實(shí)時(shí)定量PC取：可容納

17、的樣本量大，無需特殊耗材， 但溫度 一一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致。(2)離心式實(shí)時(shí)定量PC敢：能保障標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品之間反應(yīng)條件的一致性。 但可容納樣品量少，有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本。(3)各孔獨(dú)立控溫的定量PC敢：各孔獨(dú)立控溫，適合多指標(biāo)快速檢測。但 是上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要獨(dú)特的扁平反應(yīng)管，使用成本較高。7 . PCR®酸擴(kuò)增儀的溫度控制包括哪些方面？PCRS因擴(kuò)增儀的溫度控制是決定PC網(wǎng)應(yīng)能否成功的關(guān)鍵，主要包括溫度 的準(zhǔn)確性、均一性以及升降溫速度等方面。(1)溫度的準(zhǔn)確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性；(2)溫度的

18、均一性是指樣品孔間的溫度 差異，關(guān)系到不同樣品孔之間反應(yīng)結(jié)果的一致性； (3)升降溫的速度：升降溫速度快，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，提高工作效率，并提高PCRJ應(yīng)特異性。對梯度PCF來說，除此以外，還必須考慮儀器 在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。8 .為什么反應(yīng)管溫控比模塊溫控更準(zhǔn)確？反應(yīng)管溫控模式下，儀器根據(jù)探測器所探測到的溫控模塊的溫度由計(jì)算機(jī)計(jì)算出樣 品管內(nèi)或PCR5孔內(nèi)樣品液的溫度來進(jìn)行控制。由于精確的算法能自動(dòng)補(bǔ)償時(shí)間， 確保反應(yīng)混合物按照程序設(shè)定的時(shí)間維持預(yù)設(shè)溫度，所以準(zhǔn)確度更高。9 .實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀的熒光檢測系統(tǒng)主要由哪兩部分組成？ 激發(fā)光源和檢測器10 .

19、PCR擴(kuò)增儀的熱蓋有什么作用、使用時(shí)應(yīng)注意什么？目前PCRK通常都配備熱蓋，可使樣品管頂部溫度達(dá)到 150c左右，避免 蒸發(fā)的反應(yīng)液凝集于 管蓋而改變PC網(wǎng)應(yīng)體積。無需加石蠟油，減少了后續(xù) 實(shí)驗(yàn)的麻煩。旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋需注意旋轉(zhuǎn)壓力的控制，過松則使熱蓋沒有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；過緊則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能造成熱蓋的 機(jī)械故障。11 .簡述PCRT增儀的操作規(guī)程。普通PCFT增儀的操作通常為打開電源，儀器自檢，設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲(chǔ)存 的程序，運(yùn)行即 可。定量PCFT增儀的操作一般都是先打開PCRa電源，再打 開相連電腦中的相應(yīng)軟件，分別設(shè)置溫度程序、采集通道，并可根據(jù)不同儀器的要求進(jìn)行一些特殊設(shè)置，在儀器中放好 PCRT,蓋好儀器，運(yùn)行 設(shè)置好的 反應(yīng)程序。關(guān)機(jī)時(shí)通常先關(guān)軟件，再關(guān) PCR<,最后關(guān)電腦。12 .定量PCRT增儀常見故障有哪些，如何解決？定量PCFT增儀常見故障及解決方法為：（1）熒光染料污染樣品孔，解決方法是請工程師清潔樣品孔；（2） PCFRT融化， 原因可能是溫度傳 感器出問題或是熱蓋出問題，需工程師檢修；（3）個(gè)別孔擴(kuò) 增效率差異很大